倪夢(mèng)霞，王瑋，鄭愛燕，丁潔，蒲艷，鄒琴燕，孟慶霞，許詠樂，李紅，偶健

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院 生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

目前，染色體異常仍然是造成胚胎移植失敗及流產(chǎn)的主要原因，而在染色體正常的胚胎中至少有30%左右依然無法獲得成功妊娠[1]。這說明除了染色體外，還有其他因素影響IVF結(jié)局。胚胎發(fā)育是一個(gè)需要大量能量供應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程，近年來，有研究表明卵母細(xì)胞中線粒體的分布變化可以通過調(diào)節(jié)ATP的生成來影響受精能力及胚胎的發(fā)育質(zhì)量[2-3]。受精后，精子中的線粒體很快就會(huì)全部降解，胚胎中的線粒體幾乎都來自于卵母細(xì)胞。若卵母細(xì)胞發(fā)生異常，可能會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)的ATP供求不平衡，主要表現(xiàn)為染色體分離障礙、細(xì)胞分裂障礙、受精障礙等[4-7]。線粒體與其他細(xì)胞器相比，最大的特征就是含有獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，還可以通過氧化磷酸化等一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生ATP。

由于卵母細(xì)胞中的線粒體數(shù)目呈動(dòng)態(tài)變化，所以無法準(zhǔn)確計(jì)算[8-11]。而現(xiàn)有的用以評(píng)估線粒體的指標(biāo)包括線粒體DNA(mtDNA)的數(shù)量及突變、線粒體的結(jié)構(gòu)/分布及跨膜電位、ATP水平、ROS水平等[4]。本研究通過采用二代測(cè)序(NGS)的方法檢測(cè)mtDNA量，探討mtDNA量與胚胎形態(tài)、基因組及妊娠的關(guān)系，希望可以結(jié)合植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)技術(shù)篩查出質(zhì)量較好的胚胎以供患者移植。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2017年6月至2018年9月來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖中心的293個(gè)周期1 071個(gè)囊胚。所有夫婦均簽署了體外受精(IVF)和PGT知情同意書，醫(yī)院生殖倫理委員會(huì)對(duì)此研究項(xiàng)目通過倫理審查。所用胚胎均由患者簽訂知情同意用于科研。

二、研究方法

1. 囊胚期胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估：根據(jù)Garnder囊胚評(píng)分法對(duì)囊胚期胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估。先根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度將囊胚分成1～6期：1期：出現(xiàn)囊胚腔，擴(kuò)張?bào)w積小于囊胚總體積的50%；2期：囊胚腔擴(kuò)張?bào)w積大于囊胚總體積的50%；3期：囊胚腔占滿整個(gè)胚胎，但還未充分?jǐn)U張；4期：囊胚腔完全擴(kuò)張，胚胎體積增發(fā)，透明帶變??；5期：擴(kuò)張的囊胚從透明帶的破口處孵出一小部分，未能完全脫出；6期：囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞已從透明帶中孵出。3～6期囊胚再對(duì)囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)目分級(jí)為A級(jí)(細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)合緊密)、B級(jí)(細(xì)胞數(shù)目少，結(jié)合松散)、C級(jí)(細(xì)胞數(shù)目極少，不清晰)；根據(jù)3～6期囊胚的外滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目及排列形態(tài)分級(jí)為A級(jí)(細(xì)胞數(shù)目多，形態(tài)呈鐮刀形且連續(xù)平鋪在透明帶內(nèi)側(cè))、B級(jí)(數(shù)目少，排列松散，非連續(xù)姓平鋪在透明帶內(nèi)側(cè))、C級(jí)(數(shù)目極少且?guī)缀鯖]有大的滋養(yǎng)層細(xì)胞)。形態(tài)學(xué)評(píng)分3BB及以上定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，3BB以下為非優(yōu)質(zhì)胚胎。

2. 滋養(yǎng)層活檢：所有胚胎在第3天用激光技術(shù)孵化，放入新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)至第5天或第6天后，若胚胎已發(fā)育成完整的胚泡即可考慮進(jìn)行活檢。使用ZILOS-tk激光器(Hamilton Thorne BioSciences，美國(guó))對(duì)胚泡滋養(yǎng)外胚層進(jìn)行打孔后將囊胚再孵育4～6 h，待囊胚腔擴(kuò)張，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞從透明帶打孔處擠出后可進(jìn)行活檢。具體活檢方法見參考文獻(xiàn)[12]。

3. NGS-PGT：對(duì)所有活檢樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增后建庫(kù)。等溫?cái)U(kuò)增和富集后，使用PGM測(cè)序儀(ABI Ion Torrent PGM，美國(guó))進(jìn)行測(cè)序。使用Ion Reporter software進(jìn)行測(cè)序結(jié)果解讀，通過界面分析數(shù)據(jù)或后臺(tái)linux界面分析數(shù)據(jù)進(jìn)行染色體分析，以此判斷胚胎的染色體是否正常。

4. NGS-mtDNA：對(duì)PGT分析的數(shù)據(jù)(包含mtDNA和核DNA的混合物)進(jìn)行優(yōu)化計(jì)算[13]，通過將映射到線粒體基因組的讀數(shù)除以映射到核基因組的讀數(shù)，可計(jì)算出胚胎中的相對(duì)mtDNA量。每批樣本的讀數(shù)都需要進(jìn)行校準(zhǔn)，以減少NGS實(shí)驗(yàn)期間的差異性。

5. 移植策略：優(yōu)先移植PGT結(jié)果正常胚胎。如果有多個(gè)PGT結(jié)果正常胚胎則結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)估進(jìn)行移植，優(yōu)先移植形態(tài)學(xué)評(píng)分優(yōu)質(zhì)胚胎。如果無PGT正常胚胎可以移植，在充分遺傳咨詢的情況下可以考慮移植PGT嵌合結(jié)果胚胎。每次均移植一枚囊胚。

6. 分組分析：根據(jù)Garnder形態(tài)學(xué)評(píng)估分為優(yōu)質(zhì)胚胎組(n=652)和非優(yōu)質(zhì)胚胎組(n=419)；再根據(jù)PGT結(jié)果分為正常、異常、嵌合三個(gè)亞組。進(jìn)行不同組間、亞組間的比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、mtDNA量與胚胎質(zhì)量

形態(tài)學(xué)評(píng)分優(yōu)質(zhì)胚胎(3BB及以上)共652枚，非優(yōu)質(zhì)胚胎(3BB以下)共419枚。兩組間mtDNA量無顯著差異(P>0.05)，但兩組中PGT正常結(jié)果亞組的mtDNA量均顯著低于PGT異常結(jié)果亞組(P<0.05)；而兩組中的PGT嵌合結(jié)果亞組的mtDNA量與其他兩個(gè)亞組比較，均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同形態(tài)質(zhì)量/PGT結(jié)果囊胚的mtDNA量(-±s)

注：與PGT正常結(jié)果亞組比較，*P<0.05

二、mtDNA量與妊娠

2017年6月至2018年9月這一時(shí)間段PGT正常的囊胚共移植了85枚(包括68枚優(yōu)質(zhì)胚胎，17枚非優(yōu)質(zhì)胚胎)。其余PGT正常囊胚處于冷凍狀態(tài)，或者由于患者有多枚正常但只移植一枚，或者還未到患者召回移植時(shí)間暫時(shí)未移植。移植PGT正常結(jié)果組胚胎發(fā)現(xiàn)，妊娠結(jié)局為流產(chǎn)或者未孕的胚胎相比于正常妊娠組其平均線粒體DNA量在數(shù)值上較高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。以正常妊娠的平均mtDNA量0.086%作為切割值，低值組(mtDNA≤0.086%)的臨床妊娠率為73.33%，高于高值組(mtDNA>0.086%)的妊娠率(67.5%)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 PGT正常結(jié)果組不同妊娠結(jié)局的胚胎mtDNA量(-±s)

表3 以mtDNA量0.086%為切割值的臨床妊娠情況[n(%)]

有6個(gè)移植周期無PGT正常胚胎可以移植，在充分遺傳咨詢的情況下選擇PGT嵌合結(jié)果胚胎進(jìn)行移植。其中2個(gè)mtDNA量相對(duì)較高的胚胎1個(gè)未妊娠、1個(gè)流產(chǎn)，而另外4個(gè)mtDNA量相對(duì)較低的胚胎均正常分娩(表4)。

表4 PGT嵌合結(jié)果組胚胎mtDNA量與妊娠結(jié)局

討 論

雖然輔助生殖技術(shù)在近幾十年來飛速發(fā)展，但較多難題仍亟待解決。IVF的成功率依然較低，除染色體異常外，還有哪些因素會(huì)造成胚胎發(fā)育停滯？有學(xué)者認(rèn)為卵母細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量會(huì)影響受精能力及胚胎發(fā)育質(zhì)量[13-14]。線粒體作為卵母細(xì)胞中含量最豐富的細(xì)胞器，以“能量工廠”的身份為早期胚胎發(fā)育過程中的一系列細(xì)胞活動(dòng)提供ATP。胚胎發(fā)育至囊胚期，ATP的產(chǎn)生上調(diào)以滿足胚胎進(jìn)一步發(fā)育和分化所需的能量[4]。但是由于線粒體呈動(dòng)態(tài)分布，無法準(zhǔn)確計(jì)算其數(shù)目，所以要研究線粒體與胚胎發(fā)育之間的關(guān)系，還需找到可以評(píng)估線粒體數(shù)目的指標(biāo)。mtDNA作為線粒體所特有的遺傳物質(zhì)，在卵母細(xì)胞中每個(gè)線粒體只包含一個(gè)mtDNA拷貝[15]。當(dāng)胚胎發(fā)育到不同階段時(shí)，其拷貝數(shù)也會(huì)處于不同水平，因此可通過檢測(cè)mtDNA量來評(píng)估線粒體水平[16]。

近年來，很多學(xué)者都密切關(guān)注mtDNA量與IVF成功率的關(guān)系。mtDNA由于不具備核基因的修復(fù)機(jī)制，也缺乏組蛋白的保護(hù)，所以其突變率更高[5]。其發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致氧化磷酸化能力降低，從而影響卵母細(xì)胞的受精能力及胚胎的早期發(fā)育能力[8]。根據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，有一部分學(xué)者認(rèn)為mtDNA量與胚胎移植的成功率有顯著相關(guān)性，即高于一定的閾值時(shí)移植率降低，低于一定的閾值則移植率增加[17-18]。這與“quiet embryo”假說一致，quiet embryo提出代謝狀態(tài)平穩(wěn)的胚胎較代謝旺盛的胚胎存活力更高[19]。而另外一部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)mtDNA量與胚胎發(fā)育質(zhì)量之間并沒有顯著相關(guān)性[20-21]。造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因暫不明確，推測(cè)可能與種族、地域、環(huán)境及選取的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本和檢測(cè)方法有關(guān)。

本研究為了探討mtDNA量與胚胎質(zhì)量與妊娠率之間的相關(guān)性，共收集了1 071個(gè)囊胚，采用NGS進(jìn)行PGT和mtDNA量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mtDNA量與PGT結(jié)果有一定相關(guān)性：在胚胎PGT正常結(jié)果組中mtDNA量更低，而且移植PGT正常結(jié)果組胚胎其正常妊娠對(duì)應(yīng)的平均線粒體DNA量更低，但由于移植數(shù)量較少，暫未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

由于卵裂期胚胎細(xì)胞分裂時(shí)染色體分配的不穩(wěn)定[22]，嵌合胚胎隨之形成，因此卵裂期的活檢往往會(huì)發(fā)生檢測(cè)的卵裂球與實(shí)際剩下的胚胎染色體不一致的情況。因此囊胚期活檢正在逐步取代卵裂期活檢[23]。

而囊胚期的胚胎在很大程度上也都是嵌合型的胚胎，通過二代測(cè)序技術(shù)在植入前遺傳學(xué)診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)用其檢測(cè)外滋養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)一定比例的嵌合結(jié)果，在這種情況下，如何判斷胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(未來的胎兒)的狀態(tài)將是一個(gè)難題[24]。

研究推測(cè)存在一種胚胎自我修復(fù)機(jī)制，嵌合有二倍體細(xì)胞的胚胎，染色體正常和異常的細(xì)胞可能存在分裂效率和趨向的差異，非整倍體細(xì)胞最終被正常的二倍體細(xì)胞淘汰掉或者排除出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)[25-26]。在這種情況下，我們通過檢測(cè)外滋養(yǎng)層細(xì)胞的結(jié)果判斷胚胎的好壞會(huì)使我們浪費(fèi)掉寶貴的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)正常胚胎。

我們?cè)谝浦睵GT嵌合結(jié)果組胚胎時(shí)發(fā)現(xiàn)，mtDNA量較低的胚胎可能更傾向于胎兒正常結(jié)果，其正常妊娠的幾率更高。mtDNA可能給我們開啟了一個(gè)窗口，線粒體反映的是整個(gè)胚胎的能耗狀態(tài)，對(duì)于低能耗的嵌合體胚胎可能代表了其自我修復(fù)過程已趨于成功，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)正常的機(jī)會(huì)要高于那些高能耗(mtDNA量較高)的胚胎。當(dāng)然由于數(shù)據(jù)有限，要證明其相關(guān)性還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本。

綜上所述，mtDNA量的檢測(cè)可能反映胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局，也可能反映嵌合胚胎的實(shí)際狀態(tài)，未來或許可以作為胚胎選擇的一項(xiàng)補(bǔ)充指標(biāo)。但若要將這一指標(biāo)應(yīng)用于臨床，則需要進(jìn)一步加大樣本量，并且建立一定的模型來充分驗(yàn)證。