黃秋容，粟桂嬌，梁敏，王一凡，于唱，馬麗，*

（1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004）

肉桂醛是我國重要林產(chǎn)資源——肉桂油的主要成分（約占75%～90%）[1-2]。目前我國產(chǎn)的肉桂油主要是以初級香料原料出口到國外[3]，價格低廉，導(dǎo)致桂油相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益低下。利用肉桂醛開發(fā)高附加值的系列新產(chǎn)品可帶動肉桂油相關(guān)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)升級，意義重大。利用微生物轉(zhuǎn)化制備的香精香料可視為“天然品”[4-5]，附加值大大提高，是國內(nèi)外研究的熱點[6-7]。目前能運用微生物發(fā)酵工程制備的天然香料主要有天然乙偶姻[8]、天然香蘭素[9]和天然苯乙醇[10]等。關(guān)于以肉桂醛為底物通過微生物轉(zhuǎn)化合成天然苯基香精香料的研究較少。為了提高桂油相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益，利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將肉桂醛進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成更高價值的天然苯基香精香料是一個重要途徑。實現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵在于篩選出耐受、高效轉(zhuǎn)化肉桂醛的菌株。由于微生物種類的多樣性，篩菌工作量十分龐大而且微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系成分十分復(fù)雜，如圖1所示。Pennacchio 等[11]利用大腸桿菌選擇性加氫還原肉桂醛合成肉桂醇；Velasco 等[12]利用真菌Aspergillus sp.生物轉(zhuǎn)化反式肉桂醛，代謝產(chǎn)物主要有肉桂醇、3-苯丙醇、芐醇、1-苯乙醇和 2-苯乙醇；劉斌[13]、張笮晦[14]分別利用從肉桂皮和土壤中分離得到的細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化肉桂醛合成肉桂醇。為了快速篩選出高效轉(zhuǎn)化肉桂醛的目的菌株并確定其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，需要建立一種同時測定肉桂醛生物轉(zhuǎn)化體系中可能產(chǎn)物的分析方法。

圖1 肉桂醛生物轉(zhuǎn)化體系成分關(guān)系流程圖Fig.1 The flow chart of composition relationships of cinnamaldehyde biotransformation system

目前關(guān)于肉桂醛生物轉(zhuǎn)化體系中各物質(zhì)的分析方法主要有氣相色譜法[15-18]、高效液相色譜法[19-22]和紫外-可見分光光度法[23-24]等。這些方法大多只能測定其中的3 種～5 種化合物，能同時檢測10 個組分的分析方法未見報道。因此，亟待建立一種同時測定肉桂醛生物轉(zhuǎn)化體系中10 種天然苯基香精香料的分析方法，不僅可用于微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛合成天然苯基香料的生物反應(yīng)體系的成分分析，還能用于高效轉(zhuǎn)化肉桂醛合成高價值天然苯基香精香料菌株的快速篩選。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695（Separations Module）高效液相色譜儀（配 2489 UV-VIS 檢測器）、SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國 Waters 公司；Microfuge 22R 臺式微量離心機：德國Beckman Coulter 公司；BSA224S 電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；；Agilent 8453E 紫外可見分光光度計：美國安捷倫公司；SB25-12YDTD 超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

肉桂醛（AR，98 %）、肉桂醇（AR，98 %）、苯甲醛（AR，＞98.5%）、苯甲酸（AR，＞99%）：上海麥克林生化科技有限公司；肉桂酸（AR，98%）：上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；苯甲醇（AR，99%）：阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；苯乙醇（AR，97%）：美國 Acros Organics 公司；苯乙酮（GC，＞99.0%）：上海阿拉丁科技股份有限公司；3-苯丙醇（AR，98%）：上海源葉生物科技有限公司；3-苯丙醛（AR，95%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇、乙腈（均為色譜級）：德國默克公司；冰醋酸（色譜級）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸（AR，＞85%）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。試驗所用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.000 g/L）：分別準(zhǔn)確稱取10 種香精香料標(biāo)準(zhǔn)品適量，用無水乙醇溶解配成2.000 g/L的單組分標(biāo)準(zhǔn)儲備液；然后分別移取適量體積的各單組分標(biāo)準(zhǔn)儲備液于棕色容量瓶，用無水乙醇/基質(zhì)溶液（體積比1 ∶1）定容得到1.000 g/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液經(jīng)無水乙醇稀釋后得到質(zhì)量濃度范圍為2.00 mg/L～318.60 mg/L 的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品的制備

將肉桂醛生物轉(zhuǎn)化液加入等體積的無水乙醇，振蕩搖勻，靜置5 min 后用移液槍吸取2 mL 液體于2 mL EP 管，離心（12 000 r/min，5 min，25 ℃），準(zhǔn)確吸取 1 mL上清液于10 mL 棕色容量瓶，用無水乙醇定容后，再用一次性無菌注射器吸取1 mL 樣液過0.22 μm 有機濾膜待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：（30±5）℃；流動相為甲醇 ∶乙腈 ∶水 ∶冰醋酸=28.4 ∶18 ∶53.6 ∶0.04（體積比）；等梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；檢測器：UV-VIS 紫外檢測器，檢測波長：204 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方式的選擇

考察了超聲提取、振蕩提取2 種常見提取方式對微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中各組分的提取效率的影響。取同一批次的轉(zhuǎn)化液共6 份，加等量無水乙醇后，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，取其中3 份振蕩提取3 min；另外3 份超聲提取3 min（超聲頻率40 Hz，功率30%，溫度25 ℃），靜置5 min 后用移液槍吸取2 mL液體于 2 mL EP 管，離心（12 000 r/min，5 min，25 ℃），準(zhǔn)確吸取1 mL 上清液于10 mL 棕色容量瓶，用無水乙醇定容，過膜，經(jīng)高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析后，計算加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，超聲提取和振蕩提取兩種提取方式對微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中各物質(zhì)的提取效率無明顯差異。為試驗方便，選擇振蕩提取方式。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的選擇

分別取“1.2”節(jié)所配置的單組分標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的10 種物質(zhì)單標(biāo)液，以無水乙醇為空白液，通過紫外分光光度計于200 nm～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，得各組分紫外吸收光譜圖，見圖2。

如圖2 所示，微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中的10 種目標(biāo)待測物的最大紫外吸收峰在204 nm～272 nm 之間。為兼顧各化合物的檢測靈敏度，本試驗選擇204 nm 作為檢測波長。

2.2.2 流動相的選擇

圖2 10 組分紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of ten components

流動相組成和配比是高效液相色譜分離的重要影響因素之一?？疾炝思状肌⒁译婧图兯畬ι镛D(zhuǎn)化肉桂醛體系中10 種物質(zhì)的色譜分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種試劑無論是單獨或者兩兩組合用作流動相均不能將體系中的10 種物質(zhì)完全有效分離；當(dāng)流動相為甲醇 ∶乙腈 ∶水=28.4 ∶18 ∶53.6（體積比）時，各組分能實現(xiàn)有效分離。

在探究流動相比例的過程中，較高濃度時肉桂酸峰型較寬且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，這可能是肉桂酸分子離子化造成的。加酸可抑制酸的電離。試驗比較了在純水中加入0.04%磷酸和0.04%冰醋酸對改善肉桂酸峰型的效果。結(jié)果表明，在純水中加入0.04%的冰醋酸后，肉桂酸檢測靈敏度提高，峰型變窄，拖尾現(xiàn)象減輕，且對其他組分無影響。因此，最終選擇流動相為甲醇 ∶乙腈 ∶水 ∶冰醋酸=28.4 ∶18 ∶53.6 ∶0.04（體積比）。此條件下10 種目標(biāo)待測物在20 min 內(nèi)全部出峰，且分離效果良好，標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖3。

圖3 10 組分混標(biāo)液（100 mg/L）HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of ten components mixed standard solution

2.3 分析方法評價

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effects，ME）是指除目標(biāo)測定物以外的其余組分對測定結(jié)果影響，即基質(zhì)對分析方法準(zhǔn)確性的干擾，主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強和基質(zhì)抑制[25-27]。微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中的10 種物質(zhì)均為帶苯環(huán)的芳香族化合物，幾乎不溶于水，易溶于乙醇等有機溶劑。微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛轉(zhuǎn)化液有培養(yǎng)基、底物及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物等物質(zhì)，屬于非均向、多組分混合體系。參照“1.3”方法，用培養(yǎng)基溶液代替轉(zhuǎn)化液進(jìn)行預(yù)處理，制備空白基質(zhì)溶液。分別在純?nèi)軇┖涂瞻谆|(zhì)溶液加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制濃度相同的兩種檢測液，同等色譜條件下檢測，根據(jù)兩種檢測液色譜響應(yīng)值考察微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系的基質(zhì)效應(yīng)，計算公式[28-30]如下：

式中：Mi為基質(zhì)溶液中目標(biāo)測定物的基質(zhì)效應(yīng)；Ami為基質(zhì)溶液中目標(biāo)測定物的色譜峰面積；Asi為純?nèi)軇┲心繕?biāo)測定物的色譜峰面積。當(dāng)|Mi|≤20%時，可忽略而無需采取補償措施；20%≤|Mi|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；|Mi|＞50%為強基質(zhì)效應(yīng)，需采取措施補償基質(zhì)效應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中各組分的基質(zhì)效應(yīng)見表1。

表1 微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中各組分的基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Matrix effect of components in microbial transformation of cinnamaldehyde system

由表1 可知，苯乙醇、肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸基質(zhì)效應(yīng)小于20%；苯甲醛、苯甲酸基質(zhì)效應(yīng)大于50%，其他組分均為中等基質(zhì)效應(yīng)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線可抵消基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，所以本試驗采用無水乙醇/基質(zhì)溶液來配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 線性范圍與檢出限

在質(zhì)量濃度為2.00 mg/L～318.60 mg/L 的10 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行檢測，以各目標(biāo)測定物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/L），外標(biāo)法定量，得到各目標(biāo)測定物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限。以信噪比（S/N）=3 計算儀器檢出限（LOD，mg/L），各數(shù)據(jù)見列表2。

2.3.3 加標(biāo)回收率試驗與精密度試驗

取已知含量的樣品溶液，加入低、中、高3 組濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每組試驗在優(yōu)化條件下平行測6 次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表2 10 種香精香料的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear relationship，correlation coefficient and limit of detection of ten flavors

表3 10 種香精香料的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recovery rate and relative standard deviation of ten flavors（n=6）

續(xù)表3 10 種香精香料的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Continue table 3 Recovery rate and relative standard deviation of ten flavors（n=6）

結(jié)果表明，微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中各目標(biāo)化合物的回收率為92.13 %～102.90 %，RSD 為0.62 %～4.01%。說明該方法準(zhǔn)確度高，精密度好，滿足微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中各目標(biāo)化合物的測定要求。

2.4 樣品的測定

隨機選取5 組不同批次的轉(zhuǎn)化液，按“1.3”中方法處理，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測定，觀察各物質(zhì)峰型、保留時間，計算相對平均偏差（n=5）。測定結(jié)果表明，不同批次轉(zhuǎn)化液中各物質(zhì)峰型對稱，無疊峰、拖尾現(xiàn)象，保留時間基本一致，RSD 均小于5%，說明該分析方法對肉桂醛生物轉(zhuǎn)化體系中各物質(zhì)具有良好的定性定量效果。

2.5 方法的應(yīng)用

為了驗證方法的實用性，用從肉桂新鮮枝葉中篩選分離得到的內(nèi)生菌來轉(zhuǎn)化肉桂醛，轉(zhuǎn)化液用該分析方法進(jìn)行高效液相色譜分析，篩選出若干能高效轉(zhuǎn)化肉桂醛為肉桂醇的菌株，其轉(zhuǎn)化液色譜圖如圖4。

圖4 轉(zhuǎn)化液HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of a conversion solution

底物肉桂醛峰消失，新出現(xiàn)的峰比照10 組分混標(biāo)樣譜圖為肉桂醇物質(zhì)峰。峰型對稱，保留時間穩(wěn)定，表明該分析方法適用于生物轉(zhuǎn)化肉桂醛體系中產(chǎn)物的定性定量。

3 結(jié)論

本文建立一種同時測定肉桂醛生物轉(zhuǎn)化體系中10 種香精香料的高效液相色譜分析方法。10 種物質(zhì)在20 min 內(nèi)全部出峰，且峰型良好，各目標(biāo)測定物在2.00 mg/L～318.60 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（0.998 7≤R2≤0.999 6），方法檢出限（LOD，S/N=3）為 0.36 mg/L～1.16 mg/L，在低、中、高3 個加標(biāo)水平下的平均回收率為92.13 %～102.90 %，RSD 為0.62 %～4.01 %。該方法具有方便快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性高的特點，滿足肉桂醛生物轉(zhuǎn)化體系中的成分測定要求，特別適用于以肉桂醛為底物生物合成各種香精香料的篩菌工作。