王茹，方海田，*，劉慧燕，馬若霜，周婷，劉予煊，魏珊珊，李金娜，趙貝貝，胡曉磊，安廣穎

（1.寧夏大學寧夏食品微生物應用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏銀川750021；2.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川750021）

枸杞，也稱枸杞子，具有滋補肝腎、調(diào)節(jié)血糖血脂血壓、提高免疫力[1]、降低膽固醇[2]、抑制腫瘤等多方面藥理功效[3-4]。山藥為藥食兩用的植物[5]，具有抗氧化[6-7]、降血糖、血脂[8]、助消化、健脾益胃[9-10]等功效。由于酸奶具有營養(yǎng)價值高、口味獨特、易消化和吸收，在抑制腸道內(nèi)腐敗菌的繁殖、防癌、防衰老等特點，具有一定的保健作用[11-13]。

目前，關(guān)于枸杞酸奶[14-18]和山藥酸奶[19-23]等加工工藝研究越來越多，關(guān)于山藥和枸杞為原料加工酸奶的研究工藝鮮少報道，且大多以感官評價作為唯一評價指標，并未全面地考慮酸奶的各個理化特性及品質(zhì)。而響應面結(jié)合主成分分析是以主成分綜合得分作為判定指標，將多響應問題轉(zhuǎn)化為單響應問題，不僅可以降低單一目標優(yōu)化試驗的工作量，還能能獲得較好的工藝條件[24]。

由于植物乳桿菌不僅在果蔬汁中發(fā)酵中適應性較強，而且多種果蔬汁經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，在感官、衛(wèi)生、營養(yǎng)、貨架期等性質(zhì)方面都得到提升[25-26]。因此，本研究使用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌對鮮牛奶、枸杞汁和山藥汁進行發(fā)酵，進而對枸杞山藥凝固型酸乳的發(fā)酵工藝進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞、山藥、鮮牛奶、白砂糖、小蘇打：市售；異抗壞血酸鈉（食品級）：特正商貿(mào)有限公司；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌：寧夏大學農(nóng)學院生物實驗室保存；考馬斯亮、牛血清蛋白、濃硫酸、葡萄糖、苯酚、蘆?。罕本┧魅R寶科技有限公司。

RZ-988eRoyalstar 打漿機：合肥榮事達小家電公司；PB-LO pH 計：賽多利斯科學儀器有限公司；PLDHDE2.0 手持糖量計：陜西普洛帝測控技術(shù)有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀：山東省科學院研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的活化與擴大培養(yǎng)

將甘油保存的保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌分別在接種在MRS 固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h～10 h 后取出，重復3 次，使其充分活化。

用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落，接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫，振蕩培養(yǎng)8 h～10 h 后取出，按照接種量1%接入三角瓶中進行擴大培養(yǎng)（37 ℃，8 h～10 h），即可得到所需菌懸液，然后把3 種菌液按照體積比為 1 ∶1 ∶1 混合后，備用。

1.2.2 枸杞山藥乳酸菌發(fā)酵凝固型酸乳工藝流程

挑選肉厚，無腐爛的中寧枸杞和新鮮無蟲害的山藥，用流動水多次沖洗，洗掉粘在枸杞和山藥表面的污垢，枸杞按照料液比 1 ∶5（g/mL）加水，浸泡 8 h～9 h，加入護色劑（0.05%的異抗壞血酸鈉），打漿后過濾，得到枸杞汁。山藥去皮切塊后，按照料液比1 ∶5（g/mL），加入護色劑（0.05%的異抗壞血酸鈉），打漿后過濾，得到山藥汁。將鮮牛奶，枸杞汁，山藥汁和白砂糖混勻，采取巴氏殺菌法（65 ℃，25 min～35 min）殺菌。殺菌結(jié)束后，將制備好的菌液，按一定的接種比例接入牛奶中，42 ℃恒溫發(fā)酵 4 h～5 h，取出，冷卻后熟（4 ℃，12 h），得到成品。

1.2.3 枸杞山藥凝固型酸乳的單因素試驗

固定牛奶200 mL，山藥汁添加量為10%，發(fā)酵劑5 %，試驗枸杞汁添加量在不同梯度下（8 %、10 %、12 %、14%、16%）對枸杞山藥凝固型酸乳感官評價的影響；固定牛奶200 mL，枸杞汁添加量12 %，發(fā)酵劑5 %，考察山藥汁的添加量在不同梯度下（6 %、8 %、10%、12%、14%）對枸杞山藥凝固型酸乳感官評價的影響；固定牛奶200 mL，枸杞汁添加量12%，山藥汁添加量10%，試驗接種量在不同梯度下（3%、4%、5%、6%、7%）對枸杞山藥凝固型酸乳感官評價的影響。

1.2.4 響應面試驗

基于單因素試驗，確定枸杞汁添加量（A），山藥汁添加量（B），接鐘量（C）3 個因素的水平值，使用 Design-Expert 10.0.7 軟件進行分析。具體見表1。

表1 枸杞山藥凝固型酸乳工藝條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Test factors and levels of optimization response surface of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam fermentation process

1.3 測定方法

1.3.1 感官評價

枸杞山藥凝固型酸乳加工后，請15 位有豐富評定經(jīng)驗的專業(yè)人員組建感官評定小組，通過表2 分別從色澤、滋味、協(xié)調(diào)性和組織狀態(tài)對枸杞山藥凝固型酸乳進行綜合評定，總分為100 分，最后取平均值，具體見表2。

表2 枸杞山藥凝固型酸乳感官品質(zhì)評分標準Table 2 Evaluation standard of sensory quality of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

1.3.2 理化指標的測定

pH 值的測定：精密pH 計；可溶性固形物測定：手持糖量計；乳酸測定：生物傳感分析儀直接測定；蛋白質(zhì)測定：考馬斯亮藍G-250 法測定[27]；總黃酮測定：紫外分光光度法測定[28]；總糖測定：苯酚-濃硫酸法測定[29]。

1.3.3 微生物指標的測定

GB/T 4789.18-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳與乳制品檢驗》[30]。

1.3.4 主成分提取與數(shù)據(jù)處理

對枸杞山藥凝固型酸乳的各個指標進行主成分分析，提取特征值大于1 的因子，得到特征值、貢獻率和累積貢獻率，枸杞山藥凝固型酸乳的綜合評分和規(guī)范化綜合評分分別按照公式（1）和公式（2）計算。

式中：F 為綜合得分；F1、F2和 F3分別為主成分 1、2和 3 的得分；Y1、Y2、Y3分別為各個主成分的特征值；C為累積特征值；Z 為規(guī)范化綜合得分；Fmax為綜合得分最大值；Fmin為綜合得分最小值。

對響應面的試驗設計和結(jié)果分析使用Design-Expert 10.0.7 軟件進行處理，采用IBM SPSS Statistics 17.0 軟件對主成分[31-34]進行因子分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果與分析

2.1.1 枸杞汁添加量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響

枸杞汁添加量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響見圖1。

圖1 枸杞汁添加量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響Fig.1 Effect of Lycium barbarum juice addition on sensory score of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

由圖1 可知，添加的枸杞汁為12%時，感官評分為92.3 分，達到最大值，隨后感官評分迅速下降?？赡苁且驗楫斕砑拥蔫坭街陀?2%時，復合酸乳風味不顯著，突出山藥風味，缺少枸杞的香甜，當添加的枸杞汁高于12%時，隨著枸杞汁添加量的增大，出現(xiàn)枸杞臭，奶香味較淡，且酸奶的凝乳效果不佳，從而影響感官評分，故選取最佳的枸杞汁添加量為10%、12%、14%。

2.1.2 山藥汁添加量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響

山藥汁添加量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響見圖2。

圖2 山藥汁添加量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響Fig.2 Effect of Chinese yam juice addition on sensory score of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

由圖2 可知，添加的山藥汁為10%時，感官評分為91.8 分，達到最高，隨后感官評分迅速下降?？赡苁且驗楫斕砑拥纳剿幹陀?0%時，山藥風味不顯著，僅有酸奶固有的奶香味和枸杞的甜味，當添加的山藥汁高于10%時，隨著山藥汁添加量的增大，奶香味較淡，酸奶的凝乳效果變差，從而影響感官評分，故選取山藥汁添加量為10%左右最為合適。

2.1.3 接種量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響

接種量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響見圖3。

由圖3 可知，當接種量5%時，產(chǎn)品的感官評分為92 分，達到最高值。當接種量低5%時，酸奶的硬度不夠，凝乳效果不佳，當接種量高于5%時會造成酸奶的硬度過大，口感粗糙，酸奶會帶有本身的酸臭感，從而影響感官評分，因此，最適的接種量的范圍在5%左右。

2.2 響應面試驗結(jié)果

圖3 接種量對枸杞山藥凝固型酸乳感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on sensory score of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

根據(jù)Box-Behnken 中心組合設計，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以枸杞汁添加量（A），山藥汁添加量（B），接種量（C）為試驗因素，進行響應面試驗設計，共17 個試驗點，試驗設計及結(jié)果見表3。

2.3 枸杞山藥凝固型酸乳主成分分析

采用IBM SPSS Statistics 17.0 軟件對表3 中枸杞山藥凝固型酸乳各指標數(shù)據(jù)進行主成分分析。根據(jù)大于85%的累積貢獻率原則，提取了2 個主成分，累計貢獻率達到89.05%，可以較全面反映枸杞山藥凝固型酸乳的品質(zhì)信息。由各個指標特征向量絕對值的大小看出，決定第1 主成分的主要指標是乳酸含量、蛋白質(zhì)含量和乳酸菌數(shù)；決定第2 主成分的主要指標是感官評價。結(jié)果見表4。

表3 響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

為消除量綱的影響，對綜合評分進行規(guī)范化處理，得到規(guī)范化綜合評分，見表5，再以該評分作為響應值進行響應面分析。

2.4 規(guī)范化綜合評分的響應面分析

根據(jù)Box-Benhnke 中心組合設計原理，以規(guī)范化綜合得分為響應值，利用Box-Behnken 10.0.7 對數(shù)據(jù)分析，回歸擬合后，得到回歸方程為：

表4 枸杞山藥凝固型酸乳中主成分的特征值及貢獻率Table 4 Characteristic value and contribution rate of principal components in the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

表5 主成分得分值與規(guī)范化綜合評分Table 5 Principal component scores and standardized score

Y=0.98+0.016A+0.009 575B+0.19C-0.12AB+0.045AC+0.093BC-0.11A2-0.15B2-0.55C2

該模型P＜0.01，說明該模型極顯著；失擬誤差P＞0.05，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.998 6，說明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高，進一步說明該方程模擬的試驗分析是可行的。對規(guī)范化綜合評分有極顯著影響的有一次項C，交互項AB，AC，BC，平方項A2，B2，C2，對規(guī)范化綜合評分有顯著影響有一次項 A。根據(jù)F 值大小，可知影響枸杞山藥凝固型酸乳質(zhì)量的排序：C＞A＞B，即接種量＞枸杞汁添加量＞山藥汁添加量?；貧w模型及方差分析見表6。

各因素間交換作用見圖4。

由圖4 可知，枸杞、山藥添加量的響應曲面等高線呈橢圓形，表明枸杞汁和山藥汁兩者交互作用變化明顯。由接種量與枸杞汁添加量的響應曲面坡度可知，接種量的響應曲面坡度和枸杞汁添加量的響應曲面坡度較明顯，其等高線呈橢圓形，表明接種量與枸杞汁添加量兩者交互作用變化非常明顯。由接種量與山藥汁添加量的響應曲面坡度可知，接種量的響應曲面坡度和山藥汁添加量的響應曲面坡度較明顯，其等高線呈橢圓形，表明接種量與山藥汁加量兩者交互作用非常顯著。

表6 以規(guī)范化綜合評分為響應值的回歸模型及方差分析Table 6 Regression model and variance analysis with sensory score as response value

圖4 各因素間的交互作用Fig.4 Interactions between the reaction factors

2.5 優(yōu)化發(fā)酵工藝條件的確定及驗證

使用Design-Expert 10.0.7 軟件中的optimization分析，得到枸杞山藥凝固型酸乳優(yōu)化工藝條件：在鮮牛乳中，枸杞汁添加量12.18%，山藥汁添加量10.12%，接種量5.18%，此條件下枸杞山藥凝固性型酸乳的規(guī)范化綜合得分為0.993 4。為了驗證模型預測理論值的準確性和真實性，同時為了方便實際操作，將最佳發(fā)酵工藝的條件調(diào)整為枸杞汁添加量為12%、山藥汁添加量為10%、接種量為5%，在此優(yōu)化條件下試驗，得到規(guī)范化綜合評分0.993 2，與預測值誤差很小，因此，運用響應面法對枸杞山藥凝固型酸乳的工藝條件的優(yōu)化更準確合理，更具有實際指導意義。

2.6 發(fā)酵乳產(chǎn)品質(zhì)量指標

2.6.1 感官指標

呈現(xiàn)均勻的淡粉色，凝乳均勻，光滑細膩，酸甜爽口，有淡淡的枸杞和山藥的風味，具有發(fā)酵乳獨特的香味。

2.6.2 理化指標

pH 值4.15，可溶性固形物23.5%，乳酸含量達321 mg/100 mL，蛋白質(zhì)量3.2 g/100 g，總黃酮含量6.81 mg/100 mL。

2.6.3 微生物指標

乳酸菌數(shù)為2.8×108CFU/mL，致病菌，未檢出。

3 結(jié)論

本試驗以鮮牛乳，枸杞汁和山藥汁為試驗材料，并選擇保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌進行發(fā)酵來優(yōu)化枸杞山藥凝固型酸乳的發(fā)酵工藝。得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為：在鮮牛乳中，枸杞汁添加量為12 %、山藥汁添加量為10%、接種量為5%。

枸杞山藥凝固型酸乳的研制不僅增加了牛奶的營養(yǎng)成分和保健功能，還豐富了乳品市場，豐富了枸杞和山藥的加工途徑。本研究通過響應面－主成分分析法枸杞山藥凝固型酸乳的理化指標和感官評分結(jié)合起來，有效解決了多指標評價參數(shù)的問題。解決了以感官評價作為酸乳品質(zhì)評定的單一性，相較于其他酸乳的工藝而言，本研究更加全面地考慮了枸杞山藥酸乳的各個理化特性對枸杞山藥酸乳的品質(zhì)影響，使得到的枸杞山藥凝固型酸乳的工藝條件更可靠，更具有實際生產(chǎn)意義。