劉文舒 陳彥良 郭小澤 唐艷強(qiáng) 肖海紅 李思明

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌，330200)

腸道微生物是動物腸道內(nèi)棲息的微生物群落，這些微生物細(xì)胞的數(shù)量和基因數(shù)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過宿主本身[1]。腸道微生物與宿主營養(yǎng)、代謝、免疫和疾病等密切相關(guān)[2-3]。近年來，宿主腸道菌群研究成為熱點之一。

虎紋蛙(Ranarugulosa)屬于無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、蛙屬的兩棲動物，在我國分布較廣。因其體型大、味道鮮美，長期被亂捕濫殺，加上生態(tài)環(huán)境的惡化，虎紋蛙數(shù)量劇減，現(xiàn)已列為國家Ⅱ級重點保護(hù)野生動物。為滿足市場需求，中國南方地區(qū)虎紋蛙人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，但高密度養(yǎng)殖模式下腐皮病、腸胃炎、白內(nèi)障病、紅腿病和爛鰓病等細(xì)菌性疾病頻發(fā)[4-5]，造成極大損失。本研究對成體虎紋蛙不同腸道部位，通過高通量測序技術(shù)對其微生物進(jìn)行研究，探索其腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能差異，分析潛在病原菌和益生菌種類，為虎紋蛙健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

5只虎紋蛙活體(142.67±10.83)g取自江西省進(jìn)賢縣某虎紋蛙養(yǎng)殖場。在無菌超凈工作臺內(nèi)，從枕骨大孔插針快速處死，解剖，迅速取出完整腸道，按照李慶等[6]方法分離前腸、中腸和后腸，內(nèi)容物和腸道組織一起勻漿用于微生物DNA的提取。

1.2 DNA提取

使用HiPure Stool DNA Kits(美基生物，廣州，中國)，按說明書提取虎紋蛙腸道樣品的總基因組DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及回收

采用帶有8個堿基標(biāo)記的特異引物(341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT)針對16S rDNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，27個循環(huán)，最后68℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)體系如下：5 μL 10×KODbuffer，5 μL 2.5 Mm dNTPs，5 μM引物各1.5 μL，1 μL KOD聚合酶，100 ng DNA模板，加ddH2O補(bǔ)齊至50 μL，每個樣品3個重復(fù)。隨后，擴(kuò)增子用2%瓊脂糖進(jìn)行切膠回收，利用GeneJRT膠回收試劑盒(Thermo Scientific，上海，中國)純化擴(kuò)增子。

1.4 文庫構(gòu)建和高通量測序

純化后的擴(kuò)增子按照等質(zhì)量混合后，使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)分析

使用Cutadapt(V1.9.1，http：//cutadapt.readthe- docs.io/en/stable/)[7]得到有效序列后，利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/uparse/)[8]對所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，使用QIIME[9]進(jìn)行結(jié)構(gòu)和多樣性分析，使用PICRUSt軟件進(jìn)行功能預(yù)測分析[10]。

1.6 統(tǒng)計分析

通過Turkey檢驗分析組間物種多樣性和結(jié)構(gòu)差異性。

2 結(jié)果與分析

虎紋蛙前腸(HF)、中腸(HM)和后腸(HD)15個樣品共得到有效讀長1 188 162條，平均每個樣品79 120條，統(tǒng)計每個樣品的OTUs數(shù)量，所有樣品測序覆蓋度99.7%以上，表明測序比較真實反映各樣品的微生物組成(表1)。圖1展現(xiàn)3組樣品共有和特有OTU數(shù)目，HF組OTU數(shù)目為2 879個，HM組OTU數(shù)目為2 874個，HD組OTU數(shù)目為1 151個，其中3組共有的OTU數(shù)目為851個，HF和HM組共有的OTU數(shù)目為1 998個，HF和HD組共有的OTU數(shù)目為924個，HM和HD組共有的OTU數(shù)目為968個，HF組特有的OTU為808個，HM組單獨有的OTU數(shù)為759，RD組單獨有的OTU數(shù)為110。

表1 樣品OTUs

Tab.1 OTUs of each sample

2.1 虎紋蛙腸道菌群整體結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 門水平結(jié)構(gòu)分析

全部樣品共鑒定出優(yōu)勢菌群10個，為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)和產(chǎn)氧光細(xì)菌門(Oxyphotobacteria)(圖2)。核心菌群為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門。

圖1 OTUs 韋恩圖Fig.1 OTUs venn chart

2.1.2 屬水平結(jié)構(gòu)分析

對虎紋蛙腸道菌群中豐度最高的10個屬進(jìn)行統(tǒng)計(圖3)。虎紋蛙腸道中優(yōu)勢菌屬有Romboutsia屬、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、未鑒定的梭菌(unidentified_Clostridiales)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、阿里葉柄屬(Alistipes)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)和短螺旋體屬(Brachyspira)。Romboutsia、鯨桿菌屬和葉桿菌屬是核心菌屬。從圖上看，在相同腸道區(qū)域，不同個體腸道微生物在屬水平上差異較大。

2.1.3 屬水平系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

選取豐度前100的屬作為代表序列構(gòu)建而成的物種系統(tǒng)進(jìn)化樹，反映了物種的進(jìn)化關(guān)系。在進(jìn)化樹中距離越近，表明物種系統(tǒng)關(guān)系越近，圖中樹枝的不同長度代表了物種進(jìn)化的差異。進(jìn)化樹中顏色相同的屬歸屬于同一菌門，共有12個菌門和不能鑒定細(xì)菌，其中占比例最高的是變形菌門有31個屬，潛在病原菌弧菌(Vibro)、鄰單胞菌、氣單胞菌(Aeromonas)和愛德華氏菌(Edwardsiella)親緣關(guān)系較近，不動桿菌和假單胞菌(Pseudomonas)親緣關(guān)系較近；其次厚壁菌門有24個屬，其中Romboutsia屬和未鑒定的梭菌(unidentified_Clostridiales)在各樣品中出現(xiàn)頻率最高，芽孢桿菌(Bacillus)、片球菌(Pediococcus)和乳酸桿菌(Lactobacillus)等潛在益生菌親緣關(guān)系較近；梭桿菌門中的鯨桿菌屬出現(xiàn)頻率較高，且與厚壁菌門菌屬親緣關(guān)系較近；擬桿菌門有17個菌屬，發(fā)現(xiàn)蛙類常見腦膜炎致病菌伊麗莎白菌(Elizabethkingia)在部分樣品中出現(xiàn)；放線菌門有13個菌屬，潛在益生菌雙歧桿菌(Bifidobacterium)在部分樣品中出現(xiàn)。

2.2 不同腸道部位菌群差異分析

2.2.1 α多樣性分析

發(fā)現(xiàn)前腸和中腸的物種數(shù)(observed_species)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)均顯著高于后腸(P<0.05)，而前腸-中腸組間無顯著差異(P>0.05)。Shannon和Simpson指數(shù)在3組間均無顯著差異(P>0.05)。

圖2 門水平上物種相對豐度Fig.2 The relative abundance of species on the phylum level

圖3 屬水平物種相對豐度Fig.3 The relative abundance of species on the genus level

圖4 物種系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Genus species phylogeny tree

表2 不同腸道區(qū)域微生物α生物多樣性統(tǒng)計分析

Tab.2 Statistics analysis of α diversity among different intestine regions

注：數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母表示顯著差異(P≤0.05)

Note：Data marked different superscript means significant differences existed(P≤0.05)

2.2.2 降維分析

主坐標(biāo)分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)和無度量多維標(biāo)定法(NMDS，Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)是根據(jù)樣品信息，以點的形式反映在二維平面上，如果樣本距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣本傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣本則會遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。PCoA和NMDS分析結(jié)果顯示前腸和后腸樣本分布在不同的區(qū)域，微生物群落結(jié)構(gòu)相似度低，中腸樣本分布在前腸與后腸之間，表明微生物結(jié)構(gòu)介于兩者之間(圖5)。

2.2.3 門水平上結(jié)構(gòu)差異分析

虎紋蛙不同腸道部位菌群門水平結(jié)構(gòu)如圖6。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)有7個菌門相對豐度存在顯著差異(表3)。前腸厚壁菌門和梭桿菌門相對豐度顯著低于中腸和后腸(P<0.05)，中腸與后腸間差異不顯著(P>0.05)；后腸變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和產(chǎn)氧光細(xì)菌門相對豐度顯著低于前腸和中腸(P<0.05)，前腸與中腸間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.4 屬水平結(jié)構(gòu)差異分析

虎紋蛙不同腸道部位菌群屬水平結(jié)構(gòu)見圖7。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)后腸Romboutsia屬相對豐度顯著高于前腸，鯨桿菌屬相對豐度顯著高于前腸和中腸，葉桿菌屬相對豐度顯著低于前腸和中腸(P<0.05)。

圖5 不同樣品的PCoA(A)分析和NMDS(B)排序圖Fig.5 PCoA(A)analysis and NMDS(B)ordination diagram of different samples

圖6 不同腸道部位在門水平上的物種相對豐度Fig.6 The relative abundance of different section of gut at the phylum level

圖7 不同腸道部位在屬水平的物種相對豐度Fig.7 The relative abundance of different section of gut at the genus level

表3 不同腸道部位在門水平的物種相對豐度差異統(tǒng)計

Tab.3 Statistic analysis of the relative abundance of different section of gut on the phylum level %

注：數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母表示顯著差異(P≤0.05)

Note：Data marked different superscript means significant differences existed(P≤0.05)

2.3 腸道菌群功能預(yù)測

根據(jù)樣品在數(shù)據(jù)庫中的功能注釋及豐度信息，選取豐度排名前 35的功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖(圖8)?？傮w上看，前腸和中腸微生物功能相近，與后腸差異較大。在代謝功能上，前腸和中腸中與能量代謝、萜類和聚酮化合物代謝、氨基酸代謝、脂代謝、次級代謝、外源物質(zhì)降解和代謝關(guān)聯(lián)微生物豐度較高，而后腸中與核酸代謝、碳水化合物代謝關(guān)聯(lián)微生物豐度較高。前腸和中腸中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運和分解等關(guān)聯(lián)微生物豐度較高，后腸中與信號分子互作、細(xì)胞過程與信號、增殖與修復(fù)、翻譯、轉(zhuǎn)錄、酶家族、環(huán)境適應(yīng)、膜轉(zhuǎn)運等關(guān)聯(lián)微生物豐度較高。

表4 不同腸道部位在屬水平上的物種相對豐度差異統(tǒng)計

Tab.4 Statistic analysis of the relative abundance of different section of gut on the genus level %

注：數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母表示顯著差異(P≤0.05)

Note：Data marked different superscript means significant differences existed(P≤0.05)

圖8 不同腸道部位微生物功能預(yù)測Fig.8 Functional prediction of different intestine regions

3 討論

3.1 虎紋蛙腸道菌群結(jié)構(gòu)

影響腸道菌群定植的因素有很多，主要包括宿主因素(如，遺傳背景、性別、年齡、免疫系統(tǒng)、腸道動力)、環(huán)境因素(如，水源、食物、藥物)、微生物因素(如，粘附力、細(xì)菌酶、代謝方式以及生物素)等[11]。人腸道內(nèi)的細(xì)菌主要以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門(Verrucomicrobia)為主[12-13]，而小鼠腸道中主要菌群為厚壁菌門、擬桿菌門、脫鐵桿菌門、軟壁菌門(Tenericutes)[14-16]。近年來，水生動物，尤其是魚類消化道微生物成為研究焦點。魚類消化道主要由變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、產(chǎn)氧光細(xì)菌門和疣微菌門組成[17-20]。其中，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和梭桿菌門為5大主要門類[21-22]。蛙類作為兩棲動物，其腸道微生物結(jié)構(gòu)研究仍未引起廣泛關(guān)注。慕丹陽利用高通量測序方法分析黑斑蛙(Rananigromaculata)、林蛙(R.chensinensis)和牛蛙(R.catesbeiana)蝌蚪(Tadpole)的腸道微生物，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門、變形菌門為絕對優(yōu)勢菌，其次是梭桿菌門和厚壁菌門[23]。馬麗利用藍(lán)白斑篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)綠蛙(Ranaclamitans)蝌蚪消化道中微生物優(yōu)勢菌群為變形菌門、梭桿菌門和擬桿菌門[24]。攝食全豆粕蛋白飼料的牛蛙成體腸道優(yōu)勢菌群為變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門[25]。斑腿泛樹蛙(Polypedatesmegacephalus)腸道微生物核心菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和變形菌門[26]?；⒓y蛙腸道微生物結(jié)構(gòu)組成尚未見報道，本研究虎紋蛙腸道核心菌群以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門為主導(dǎo)。比較以上研究結(jié)果，從主要核心菌門上看，蛙類腸道微生物與人類、哺乳動物和魚類差異較大，而且不同蛙種類間腸道微生物差異也較大，表明蛙類在進(jìn)化過程中，腸道微生物隨著環(huán)境、發(fā)育等因素影響，形成了差異。

益生菌在水生動物生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛，可作為添加劑以提高動物生長、免疫和抗病性，作為調(diào)水劑以改善水質(zhì)[27-29]，但是非宿主來源的益生菌在使用過程中存在潛在風(fēng)險，宿主來源的益生菌更值得關(guān)注和挖掘[30]。本研究中，發(fā)現(xiàn)潛在益生菌芽孢桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌等存在于在虎紋蛙腸道中。而水生動物常見的條件致病菌弧菌、鄰單胞菌、氣單胞菌、愛德華氏菌不動桿菌屬、黃桿菌屬(Flavobacterium)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、伊麗莎白菌等均有發(fā)現(xiàn)，而且弧菌和愛德華氏菌在不同個體中出現(xiàn)頻率最高。這些發(fā)現(xiàn)為虎紋蛙專屬益生菌的開發(fā)和細(xì)菌疾病的防治提供了參考意義。

3.2 虎紋蛙不同腸道部位菌群結(jié)構(gòu)與功能差異

由于消化道不同部位理化性質(zhì)的差異，消化道菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)有很大差別[31]。以魚類為例，多數(shù)研究證明多種魚類消化道不同區(qū)段從前到后菌群數(shù)量呈逐漸上升趨勢[32-36]，且腸道中的菌群數(shù)量最多。然而，Austin等發(fā)現(xiàn)虹鱒(Oncorhynchusmykiss，Walbaum)各段消化道細(xì)菌數(shù)量呈逐漸下降的趨勢[37]，Ring?等研究發(fā)現(xiàn)北極嘉魚(SalvelinusalpinusL.)小腸和大腸的細(xì)菌數(shù)量是恒定的[38]。Ye等研究比較了黃魚(Dorosomacepedianum)前腸和后腸菌群組成，發(fā)現(xiàn)黃魚后腸中菌群量最大且α-多樣性指數(shù)最大[39]。本研究中虎紋蛙前腸和中腸α-多樣性指數(shù)顯著高于后腸，這與大多數(shù)魚類研究結(jié)果相反。

在門水平上，虎紋蛙后腸擬桿菌厚壁菌門和梭桿菌門豐度高于和中腸。厚壁菌通過分解纖維素，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，以提高宿主的營養(yǎng)利用率，維持腸道微生物生態(tài)平衡，還可經(jīng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞調(diào)控IL-10的表達(dá)，改善腸道黏膜炎癥；梭桿菌門中的絕對優(yōu)勢菌鯨桿菌屬能夠發(fā)酵多肽碳水化合物，產(chǎn)生有益的維生素B12[40-42]。PICRUSt預(yù)測前腸和中腸中與脂代謝、氨基酸代謝、外源物質(zhì)降解和代謝關(guān)聯(lián)微生物豐度較高，而后腸中與碳水化合物代謝關(guān)聯(lián)微生物豐度更高。我們推測虎紋蛙前腸和中腸可以直接消化、吸收脂肪和氨基酸，更難分解的碳水化合物進(jìn)入到后腸，在微生物的幫助下降解利用。有研究發(fā)現(xiàn)，虎紋蛙腸道脂肪酶活力大小次序是中腸>后腸>前腸，淀粉酶活力大小次序是前腸>中腸>后腸，蛋白酶活力大小次序是前腸>后腸[6，43]。脂肪酶和蛋白酶活力大小與PICRUSt預(yù)測結(jié)果基本一致，但是淀粉酶活力與微生物功能預(yù)測結(jié)果并不一致，腸道微生物功能預(yù)測與腸道生物酶活間的評估還有待進(jìn)一步的研究。