王湘君 陳 文 林熾賢 唐海麗，3

(1.海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院，兩棲爬行動物研究省級重點實驗室，三亞，572022；2.海南熱帶海洋學(xué)院理學(xué)院，三亞，572022；3.三亞二中，三亞，572099)

1 前言

竹葉青蛇屬(Trimeresurus)，屬于有鱗目(Squamata)，蝰科(Viperidae)，蝮亞科(Crotalinae)，廣義竹葉青蛇屬，目前國際公認共37個物種[1]。據(jù)《中國動物志》記載[2]，中國分布有6種竹葉青蛇屬蛇類，其中海南島分布有兩種，即白唇竹葉青蛇(Trimeresurusalbolabris)和福建竹葉青蛇(海南亞種)(Trimeresurusstejnegerihainanensis)。白唇竹葉青蛇是竹葉青蛇屬中分布最廣的一種，主要分布在東亞和東南亞[3]，海南島的白唇竹葉青蛇并未被定為亞種[2]。研究其線粒體基因組，有利于進一步研究其分類、進化、擴散等[4-5]，希望此研究能提供一個有用的數(shù)據(jù)庫以分析蝰科毒蛇的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[3，6-9]。

Song等[3]和Zhu等[6]，以及Lin在NCBI上提交的序列[10]分別對白唇竹葉青蛇、四川竹葉青蛇(Trimeresurussichuanensis)和福建竹葉青蛇的線粒體全序列做出了分析。但文中并沒有提到白唇竹葉青蛇和福建竹葉青蛇的標本產(chǎn)地。

原矛頭蝮屬(Protobothrops)蛇類也隸屬于廣義竹葉青蛇屬，與竹葉青蛇屬親緣關(guān)系很近。Huang 等、Zhang 等、Kang等[7-9]對多種原矛頭蝮屬蛇類的線粒體基因組也做出了分析，豐富了GenBank數(shù)據(jù)庫。

作者擬對海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體基因組進行測序，分析其基因和堿基的組成，并與近緣物種進行比較其差異性，以豐富線粒體基因組數(shù)據(jù)庫。

2 材料與方法

2016年于海南省樂東縣采得竹葉青蛇樣本一號，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，進行初步鑒定。取其新鮮個體的肝臟，保存于95%乙醇，送至北京六合華大基因科技公司進行DNA提取和線粒體全序列測定。

表1 PCR反應(yīng)條件

Tab.1 Reaction requirement for PCR

運用 DNASTAR 軟件包里的 Seq Builder 做全序列的基因組結(jié)構(gòu)圖，利用 Editseq 對堿基含量進行計算。GC 偏斜值根據(jù) Pema 和Kocher1995 年所定義的公式[11]：GC-skew=(G-C)/(G+C)計算，AT 的偏斜值也用類似的方法計算。GC 的含量越高，偏斜值越小[12]。運用 DNAstar 軟件對選取的全序列進行堿基含量分析。

將全序列放入NCBI，運用BLAST功能(nucleotide to nucleotide)進行比對，確定為白唇竹葉青蛇。并與近緣物種(竹葉青蛇屬、原矛頭蝮屬)物種進行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果

據(jù)《中國動物志》記載[2]，海南島分布有2種竹葉青蛇，即福建竹葉青蛇和白唇竹葉青蛇。作者根據(jù)所獲標本的外部形態(tài)，第一上唇鱗和鼻鱗僅有不完全鱗溝，初步鑒定為白唇竹葉青蛇。

測得目標個體線粒體基因組全序列長度為17 222 bp，為環(huán)狀閉合DNA，如圖1所示。

與其他蛇類基因相似，包括 13個蛋白質(zhì)編碼基因，22個tRNA、2個rRNA、2個控制區(qū)(D-loop)和輕鏈復(fù)制起始區(qū)(OL)，與其他已經(jīng)報道的脊椎動物線粒體基因結(jié)構(gòu)相同。除ND6亞基基因和L鏈上編碼的8個tRNA基因外，其余基因均分布在H鏈上。主要特征如表2。

圖1 海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Organization in the mitochondrial of of T.albolabris from Hainan island

表2 海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體基因組結(jié)構(gòu)和特征

Tab.2 The mitochondrial genome structure and characteristics of T.albolabris from Hainan island

H=Heavy strand，重鏈；L=Light strand，輕鏈

3.2 分析

其線粒體基因組全序列的堿基中，A的含量為33.4%，C的含量為27.3%，G的含量為12.3%，T的含量為27%。此測定結(jié)果其中，A+T的含量(60.4%)明顯高于G+C的含量(39.6%)，AT的偏斜為0.11，GC的偏斜為-0.38，即AT的偏斜大于GC，這與脊椎動物線粒體DNA的L鏈堿基組成一致[13-14]。A的含量明顯偏高，而G明顯偏低，與其他蛇類此片段堿基組成比例相當[15-19](表3)。

表3 海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體基因組堿基含量

Tab.3 The nucleotide content of mitochondrial genome of Trimeresurus albolabris from Hainan island

注：AT skew=(A-T)/(A+T)，GC skew=(G-C)/(G+C)

4 討論

此序列與NCBI上編號為KF311102的白唇竹葉青蛇總相似度為99.61%[3]；文中并未提到采集地點；根據(jù)文中的項目基金，作者推測采集于安徽。

此序列與編號為FJ752492的福建竹葉青蛇總相似度為89.37%[10]，因此可以進一步確認其為白唇竹葉青蛇。與編號為KT266810的四川竹葉青蛇總相似度為88.33%[6]，該兩號標本分別采集于四川省合江縣和貴州省江口縣。

4.1 線粒體各區(qū)域基因

4.1.1 蛋白質(zhì)編碼基因

海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體上的13個蛋白基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、ATP6、ATP8、COX1、COX2、COX3、Cytb)的長度范圍為67—1 788 bp，總長度是17 222 bp，占全序列的60%。所有基因的起始密碼子均為ATG。COXIII、Cytb基因的終止密碼子為不完全終止密碼子T，ATP8、ATP6基因的終止密碼子都為TAA。

4.1.2 核糖體RNA基因

海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體基因組包含2個核糖體RNA基因，分別為12S rRNA和16S rRNA，兩者之間由tRNA-Val基因隔開。12S rRNA基因的長度為907 bp，16S rRNA基因的長度為1 477 bp，12S rRNA基因的堿基中，A的含量為36.8%，C的含量為25.1%，G的含量為17.0%，T的含量為21.1%，A+T的含量為57.9%，G+C的含量為42.1%，GC的偏斜為-0.19，AT的偏斜為0.27；16S rRNA基因的堿中，A的含量為22.8%，C的含量為22.6%，G的含量為14.1%，T的含量為22.8%，A+T的含量為61.4%，G+C的含量為36.7%，GC的偏斜為-0.23，AT的偏斜為0.26。兩者堿基含量的差別很小，說明兩者存在相似的進化率。

4.1.3 轉(zhuǎn)運RNA基因

海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體基因組全序列包含22個tRNA基因(tRNA-Phe、tRNA-Val、tRNA-Leu(UUR)、tRNA-Ile、tRNA-Gln、tRNA-Met、tRNA-Trp、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser(UCN)、tRNA-Asp、tRNA-Lys、tRNA-Gly、tRNA-Arg、tRNA-His、tRNA-Ser(AGY)、tRNA-Leu(CUN)、tRNA-Glu、tRNA-Thr、tRNA-Pro)，長度范圍為55—343 bp，總長度為1 734 bp，堿基中A的含量為33.89%，G的含量為17.26%，T的含量為24.94%，C的含量為23.89%，A+T的含量為0.16，G+C的含量為-0.15。

4.1.4 非編碼區(qū)域

海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇線粒體基因組全序列的非編碼區(qū)域包括控制區(qū)(D-loop)和輕鏈復(fù)制起始區(qū)(OL)。D-loop區(qū)位于tRNA-Phe和tRNA-Thr之間，長度為1 067 bp，A的含量為27.3%，C的含量為25.5%，G的含量為12.0%，T的含量為35.2%，A+T的含量為62.5%，G+C的含量為37.5%。A+T的含量遠大于G+C的含量。O區(qū)位于tRNA-Asn和tRNA-Cys之間，長度為33 bp。

4.2 與福建竹葉青蛇線粒體基因組比較

據(jù)《中國動物志》記載，海南產(chǎn)竹葉青蛇有兩個物種，即白唇竹葉青蛇與福建竹葉青蛇，海南產(chǎn)福建竹葉青蛇命名為福建竹葉青蛇海南亞種(T.s.hainanensis)。

白唇竹葉青蛇線粒體基因組全序列的長度為17 222 bp，NCBI上公布的福建竹葉青蛇(T.stejnegeri，F(xiàn)J752492)線粒體基因組全序列的的長度17 239 bp[6]兩者相差17 bp，相似度為89.37%。蛋白質(zhì)編碼區(qū)的長度范圍為11 300—11 362 bp，G+C堿基含量范圍為39.05%—39.59%；核糖體RNA基因的長度范圍為2 384—2 399 bp，該部分的變化范圍較大，G+C堿基含量范圍為39.4%—41.4%；轉(zhuǎn)運RNA基因的長度范圍為1 456—1 734 bp，G+C堿基含量范圍為39.05%—39.59%；D-loop區(qū)基因的長度范圍為1 062—1 067 bp，G+C堿基含量范圍37.2%—37.5%。

白唇竹葉青蛇線粒體基因組全序列的堿基與福建竹葉青蛇相比，A的含量多0.3%，C的含量少0.9%，G的含量為少0.3%，T的含量多1%。白唇竹葉青蛇A+T的含量(60.4%)大于G+C的含量(39.6%)，福建竹葉青蛇A+T的含量(59.1%)大于G+C的含量(40.8%)。因此白唇竹葉青蛇A+T的含量比福建竹葉青蛇多1.3%，G+C的含量少1.2%。

福建竹葉青蛇的AT偏斜值為0.12，GC偏斜值為-0.38，GC的偏斜的絕對值大于AT的偏斜值；白唇竹葉青蛇GC偏斜值為-0.38，AT的偏斜值為0.11，GC的偏斜的絕對值也是大于AT的偏斜值。

4.3 與原矛頭蝮線粒體基因組比較

GenBank上與作者測得序列相似度最高的序列，還有10個物種，49個個體原矛頭蝮屬蛇類線粒體基因全序列，其相似度大于85%[10](表4)。

表4 白唇竹葉青蛇與原矛頭蝮屬蛇類線粒體基因組的相似性

Tab.4 The similarity of mitochondrial genome between T.albolabris and Protobothrops app.

由于與核DNA相比，線粒體的體積小、母體遺傳、突變率加快，并且很少或根本沒有重組，線粒體基因組序列已被證明在幾個分類水平上對系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系有用[20]。本研究結(jié)果有助于瀕危物種遺傳資源的保護，有助于毒蛇的遺傳鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[21]，希望為分析海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇和其他毒蛇的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供一個有用的數(shù)據(jù)庫。

5 結(jié)論

海南產(chǎn)白唇竹葉青蛇的線粒體基因組全長17 222 bp，其基因結(jié)構(gòu)與堿基組成比與其他蛇類基因相似。此序列與其他產(chǎn)地的白唇竹葉青蛇相似度為99.61%，與福建竹葉青蛇相似度為89.37%，與四川竹葉青蛇相似度為88.33%，與原矛頭蝮屬蛇類相似度大于85%。