付 恬 林 江 孫 靜 呂欣孺 李 祥 楊曉宇馬沛然 李 儀 初 冬 耿海東 孫賀廷 謝林紅彭 鵬 秦思源 馮爾輝 楊思遠 孫 穎* 王玉龍* 柴洪亮*

(1.東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.海南東寨港國家級自然保護區(qū)管理局，?？?，571129；3.國家林業(yè)和草原局森林和草原病蟲害防治總站，沈陽，110034；4.黑龍江民族職業(yè)學院，哈爾濱，150066)

禽流感(avian influenza，AI)是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類的一種烈性的高度接觸性傳染病[1]。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)不僅僅感染禽類，還可以跨越物種屏障感染哺乳動物，甚至人類。高致病性禽流感被世界動物衛(wèi)生組織列為A類動物疫病，我國將其列為I類動物疫病。新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經紊亂、黏膜和漿膜出血為特征[2-3]。ND具有很高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病，OIE將其列入OIE疾病名錄，我國將其列為I類動物傳染病。

野鳥尤其是野生水禽是AIV和NDV的天然宿主，大多數學者認為野鳥在AIV和NDV傳播過程中起著重要作用[4-5]。同域活動的帶毒候鳥、留鳥與家禽之間，存在著交叉感染的可能性，這為病毒基因重組創(chuàng)造了機會。海南省位于全球8大候鳥遷徙路線中的東亞-澳大利西亞以及中亞-印度線上，是候鳥遷徙必須經過的停歇地以及越冬地。此外，海南更是以文昌雞、嘉稷鴨聞名的我國重要的家禽養(yǎng)殖區(qū)域。

本研究選取海南省北部的海口與文昌地區(qū)的塔市村、道學、三江、竹山、旗調、貝坡、榜頭等7個監(jiān)測點于2018年2月中旬采集野鳥糞便樣本，對海南北部地區(qū)野鳥攜帶AIV和NDV狀況進行監(jiān)測，進而掌握海南北部地區(qū)野鳥感染禽流感和新城疫病毒的基本情況。

1 實驗方法

1.1 樣品采集

于2018年2月中旬選取海南省海口到文昌兩地的北部沿海地區(qū)為采樣區(qū)域，包括塔市村、道學、三江、竹山、旗調、貝坡、榜頭等7個沿海海邊地點，總共采集了288份新鮮濕潤的野鳥糞便樣品(表1)，及時保存在含有樣品保存液(成分：甘油、硫酸鏈霉素、青霉素鈉、PBS)的離心管中，冷鏈運輸至實驗室。

1.2 樣品處理

將采集到的糞便樣品編號，振蕩混勻，靜置半分鐘，取上清液200 mL置于新的離心管中，再加入抗生素，混合備用。

1.3 病毒分離

取處理好的樣品，采用雞胚尿囊腔接種法[6]，接種于9—11日齡SPF雞胚尿囊腔中，每個樣品接種2枚雞胚，接種量為0.2 mL/枚，于37℃全自動孵化器中孵化72 h，每隔24 h照胚1次。棄去24 h內死亡的雞胚，盲傳兩代，無菌條件下收獲24—72 h內的死胚及活胚的尿囊液，備用。

1.4 血凝試驗

血凝試驗采用濃度為1%的SPF雞紅細胞懸液。對收取的尿囊液進行血凝試驗[6]，測定血凝效價并記錄。

1.5 RT-PCR試驗

采用Trizol試劑法提取血凝陽性樣品RNA，然后將RNA反轉錄為cDNA，用本實驗室設計保存的AIV(M、NS、HA)和NDV(F、NDV1/2)特異性引物分別進行禽流感和新城疫病毒RT-PCR鑒定。以 cDNA為模板，按照如下體系擴增：10 μL 2×TaqPCR StarMix預混液，2 μL引物(上、下游引物各1 μL)，1.5 μLcDNA，用去離子水將體系補充至25 μL。RT-PCR反應程序設定30個循環(huán)，具體反應溫度見表2。

表1 采樣地點主要野鳥品種及采樣情況

Tab.1 Main wild bird species and sampling conditions at sampling sites

表2 RT-PCR反應程序

Tab.2 RT-PCR amplification procedure

2 結果

2.1 血凝試驗結果

樣品接種SPF雞胚，傳胚兩代，收取每一代尿囊液進行血凝實驗。228份樣品中只有2份樣品為血凝陽性(2份樣品分別采自道學站和竹山，當地常見野鳥品種為鸻鷸類和鷺類)，其余樣品均顯示血凝陰性結果。血凝陽性樣品效價見表3。

表3 血凝試驗結果

Tab.3 Result of the HA test

2.2 RT-PCR鑒定結果

將血凝陽性樣品進行RT-PCR試驗，然后進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。AIV鑒定引物M、NS、HA擴增的目的片段長度分別為1 020 bp、838 bp、640 bp；NDV鑒定引物F、NDV1/2擴增的目的片段長度分別為486 bp、375 bp。結果如圖1—圖5，陽性對照樣品均出現(xiàn)相應的目的條帶，而兩份血凝陽性樣品的結果均為陰性。

圖3 HA640引物RT-PCR擴增結果Fig.3 RT-PCR amplification result of HA640 注：M.DNA標準DL2000；1.陰性對照；2—3.HA76、HA226；4.HA640陽性對照 Note：DL2000 DNA Maker.1.Negative control.2-3.Samples HA76，HA226.4.HA640 positive control

圖4 NDV1/2引物RT-PCR擴增結果Fig.4 RT-PCR amplification result of NDV 1/2 注：M.DNA標準DL2000；1.1/2陽性對照；2—3.HA76、HA226；4.陰性對照 Note：DL2000 DNA Maker.1.NDV 1/2 positive control.2-3.Samples HA76，HA226.4.Negative control

圖5 NDV F引物RT-PCR擴增結果Fig.5 RT-PCR amplification result of NDV F 注：M.DNA標準DL2000；1.陰性對照；2—3.HA76、HA226；4.F陽性對照 Note：DL2000 DNA Maker.1.Negative control.2-3.Samples HA76，HA226.4.NDV F positive control

3 討論

近年來，世界各地相繼暴發(fā)AI和ND疫情，AI和ND是家禽養(yǎng)殖業(yè)和野生動物種群健康的一大嚴重威脅，AI更是嚴重威脅人類健康的人畜共患病。在全球8條候鳥遷徙路線中，亞太地區(qū)的水鳥遷徙主要有3條通道，分別為西太平洋、東亞-澳大利西亞及中亞-印度，這3條通道都與中國鳥類遷徙有著密切關系[7]。?？谂c文昌兩市地處海南省北部沿海地區(qū)，是東亞-澳大利西亞以及中亞-印度遷徙路線上重要的地理區(qū)域，是部分候鳥重要的越冬地，也是許多候鳥繼續(xù)遷徙飛往東南亞國家途中的停歇地。海南地處熱帶，其溫暖的氣候與適宜的環(huán)境造成當地留鳥種類繁多。嘉積鴨和文昌雞是海南特有的“四大名菜”之二，其相關養(yǎng)殖產業(yè)是海南重要經濟來源，近年來文昌雞更是向其他地區(qū)供應[8-10]。這為AIV、NDV在當地候鳥、遷徙留鳥及本地家禽之間循環(huán)傳播及重組變異提供了便利條件，對AIV、NDV在當地的流行傳播有著重大影響。因此對海南地區(qū)野鳥AIV、NDV攜帶狀況進行流行病學監(jiān)測具有重要意義。

海南省地處熱帶，氣候屬于熱帶海洋性季風氣候。采集樣品時正處于2018年2月中旬，屬于初春時期，候鳥剛度過越冬期大部分還未開始向北方遷徙。采樣時采樣點的主要鳥類如鸻鷸類、鷺類均為候鳥，而八哥(Acridotherescristatellus)、珠頸斑鳩(Streptopeliachinensis)為當地留鳥，說明留鳥與候鳥之間相互存在著交叉感染的可能性。

本研究于2018年2月在海南北部地區(qū)總共采集了288份野鳥糞便樣品，結果有2份樣品呈血凝陽性，進一步采用RT-PCR試驗鑒定結果顯示AIV、NDV均為陰性。本研究可為海南北部沿海地區(qū)野鳥攜帶禽流感與新城疫病毒情況提供本底數據。2份樣品呈血凝陽性，但AIV和NDV鑒定結果均為陰性，經分析可能原因如下：(1)本研究僅對AIV與NDV進行了檢測，其他病原微生物如幾種腸產毒素型大腸桿菌、雞毒支原體、腺病毒等也含有血凝素，均能夠引起雞的血紅細胞凝集現(xiàn)象，所以2份樣品呈現(xiàn)血凝陽性，可能存在其他病原微生物。(2)禽流感病毒主要通過禽類的呼吸道分泌物和糞便大量排出，病毒可在0—4 ℃水中至少存活1個月、4 ℃糞便中存活35 d、37 ℃糞便中生存6 d[11]。當地氣候溫暖，溫度較高，不適宜病毒生存，因此導致樣品中分離不到AIV和NDV。(3)采樣地點主要集中于北部偏東部海岸地區(qū)，采集樣本數量較少，這也是沒有檢測到病毒的一種可能。其他原因如樣品運輸距離較遠導致樣品不夠新鮮、采集時期不是疫情高發(fā)期等原因也有可能造成采集樣品經檢測均為AIV及NDV陰性的結果。

根據廖飛等[12]和解林紅等[13]的研究，并結合本研究結果顯示，近期野鳥不是海南北部沿海地區(qū)禽流感和新城疫的主要傳播源，當地在近期不存在疫情暴發(fā)的高危風險。但是在候鳥越冬遷徙期仍需要對海南地區(qū)進行監(jiān)測，尤其在海南周邊鄰國及國內地區(qū)的遷徙路線上暴發(fā)疫情時需嚴密監(jiān)測，以便及時預警做好防控措施。