黃 杰 劉 磊 楊 波 楊承忠

(1.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，商丘，476000；2.中國大熊貓保護(hù)研究中心，都江堰，611830；3.重慶師范大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，401331)

微衛(wèi)星(Microsatellite)，是基因組中以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(一般1—6個(gè))為基本短重復(fù)單元組成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列[1]。微衛(wèi)星標(biāo)記具有序列短、突變率高、選擇中性、多態(tài)性豐富、通用性強(qiáng)、分布廣泛、數(shù)量眾多、檢測容易、重復(fù)性好等特點(diǎn)，被廣泛用于物種的遺傳學(xué)研究[2]。近年來常被用于動(dòng)物的親權(quán)鑒定[3]、個(gè)體識(shí)別[4]、連鎖分析[5]、物種進(jìn)化[6]、指紋分析[7]、遺傳疾病[8]等方面的研究。

普通鸕鶿(Phalacrocoraxcarbo)，又名鸕鶿、大鸕鶿，隸屬于鵜形目(Pelecaniformes)，鸕鶿科(Phalacrocoracidae)，鸕鶿屬，是一種極為常見的海鳥，全身為帶金屬光澤的藍(lán)黑色，眼和嘴后方的裸露皮膚黃色，并有寬廣的白帶[9]。普通鸕鶿廣泛分布于世界各地，繁殖于中國各地的適宜生境，種群的數(shù)量趨于穩(wěn)定，屬低危(LC)物種[10]。

目前國內(nèi)外學(xué)者對普通鸕鶿的研究主要集中于其繁殖期對筑巢樹的選擇[11]、營養(yǎng)級(jí)結(jié)構(gòu)分析[12]、線粒體基因組分析[13]、糞便寄生蟲研究[14]等，而有關(guān)普通鸕鶿基因組微衛(wèi)星分布規(guī)律迄今知之甚少。近年來，由于棲息地破碎化、環(huán)境污染和大量的人為捕獵，普通鸕鶿的數(shù)量逐漸下降，因此對普通鸕鶿的保護(hù)顯得尤為重要。生物多樣性保護(hù)是物種保護(hù)的重要方面，其中，遺傳多樣性降低會(huì)使物種的適應(yīng)環(huán)境能力和抵抗疾病的能力明顯下降[15]。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要通過蛋白質(zhì)[16]、線粒體DNA[17]、MHC基因[18]、微衛(wèi)星DNA[19]、SNPs[20]等一系列分子標(biāo)記進(jìn)行種群遺傳多樣性研究。本研究是在普通鸕鶿基因組水平上，對其微衛(wèi)星進(jìn)行搜索，進(jìn)而分析其分布情況，為今后建立完整的普通鸕鶿種群遺傳背景資源庫、個(gè)體識(shí)別、遺傳多樣性分析等相關(guān)方面的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究中普通鸕鶿基因組序列下載自http：//www.diark.org/diark/species網(wǎng)站，該基因組序列大小約1.0 GB，下載的所有序列均以FASTA格式進(jìn)行保存，以備分析。

1.2 方法

采用微衛(wèi)星搜索及統(tǒng)計(jì)軟件MSDB v2.4(http：//msdb.Biosv.com)[21]，對普通鸕鶿基因組的序列進(jìn)行搜索和統(tǒng)計(jì)，獲得微衛(wèi)星相關(guān)類型和重復(fù)數(shù)量等信息。

本研究微衛(wèi)星序列分析用到如下術(shù)語：

(1)重復(fù)類型：即重復(fù)序列中的每個(gè)重復(fù)單元的堿基數(shù)，現(xiàn)研究的微衛(wèi)星的重復(fù)類型有6種。

(2)重復(fù)拷貝類別：是每種重復(fù)類型不同的堿基組合。

(3)重復(fù)拷貝數(shù)：即每個(gè)重復(fù)拷貝類別的重復(fù)數(shù)，如(GTC)12表示GTC重復(fù)拷貝數(shù)為12。

(4)重復(fù)數(shù)目：每種重復(fù)拷貝類別在基因組中的數(shù)目[22]。

(5)豐度：指1Mb基因組序列中微衛(wèi)星數(shù)量，單位(個(gè)/Mb)。

(6)密度：指1Mb基因組序列中微衛(wèi)星總長度，單位(bp/Mb)。

1.3 統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：

單堿基重復(fù)序列拷貝數(shù)≥12；二堿基重復(fù)序列拷貝數(shù)≥7；三堿基重復(fù)序列拷貝數(shù)≥5；四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)序列拷貝數(shù)均≥4。本研究中，將所有與其互補(bǔ)的序列和可循環(huán)的序列分為同一類型，如三堿基重復(fù)ACT與ACT、CTA、TAC、TGA、GAT、ATG可合并為同一類型，因此，單堿基重復(fù)類型有2種，二堿基有4種類型，三堿基有10種類型，四堿基有33種類型，五堿基有102種類型，六堿基有350種類型[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各類型微衛(wèi)星重復(fù)序列數(shù)目和相應(yīng)的百分比

普通鸕鶿基因組序列中，用MSDB v2.4微衛(wèi)星搜索軟件共搜索到135 498個(gè)不同類型重復(fù)序列，總長度約為2 304 711 bp。所有的重復(fù)類型如表1所示，單堿基重復(fù)數(shù)目最多，為102 005個(gè)，總長度為1 466 603 bp，豐度為102.8個(gè)/Mbp，占重復(fù)類型總數(shù)目的75.3%；其次是四堿基重復(fù)類型，為10 663個(gè)，總長度為289 560 bp，豐度為10.8個(gè)/Mbp，占重復(fù)類型總數(shù)目的7.8%；二堿基重復(fù)類型，為9 399個(gè)，總長度為160 132 bp，豐度為9.5個(gè)/Mbp，占重復(fù)類型總數(shù)目的6.9%；三堿基重復(fù)類型，為8 813個(gè)，總長度為152 043 bp，豐度為8.9個(gè)/Mbp，占重復(fù)類型總數(shù)目的6.5%；五堿基重復(fù)類型，為4 004個(gè)，總長度為203 835 bp，豐度為4.0個(gè)/Mbp，占重復(fù)類型總數(shù)目的3.0%；最少的是六堿基重復(fù)類型，為614個(gè)，總長度為32 538 bp，豐度為0.6個(gè)/Mbp，僅占重復(fù)類型總數(shù)目的0.5%。

表1 不同重復(fù)類型的微衛(wèi)星在普通鸕鶿基因組的分布情況

Tab.1 Distribution of SSR for different repeat types in genomic of Phalacrocorax carbo

2.2 各重復(fù)類型拷貝數(shù)的數(shù)量分布

如表2所示，在單堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為A的重復(fù)數(shù)目最多，為98 605個(gè)，所占比例為96.67%；在二堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為AC的重復(fù)數(shù)目最多，為5 206個(gè)，所占比例為55.39%，其次是AT重復(fù)拷貝類別，數(shù)目為2 501，占二堿基重復(fù)序列總數(shù)目的26.61%；在三堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為AAT的重復(fù)數(shù)目最多，為2 667個(gè)，所占比例為30.26%，其次是AAC重復(fù)拷貝類別，數(shù)目為1 783，占三堿基重復(fù)序列總數(shù)目的20.23%；在四堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為AAAC的重復(fù)數(shù)目最多，為3 275個(gè)，所占比例為30.74%，其次是AAAT重復(fù)拷貝類別，數(shù)目為1 950，占四堿基重復(fù)序列總數(shù)目的18.30%。

2.3 不同重復(fù)拷貝類型的重復(fù)次數(shù)分布

如圖1所示，在普通鸕鶿基因組中微衛(wèi)星數(shù)量最多的前16種重復(fù)拷貝類別依次為A、AC、C、AAAC、AAT、AT、AAAT、AAC、AG、AGG、AAAG、AAGG、ACC、ACG、AACC、AGC。其中均為單堿基、二堿基、三堿基和四堿基重復(fù)類型，而且這些重復(fù)拷貝類別的微衛(wèi)星數(shù)量都在500個(gè)以上，總數(shù)是126 226個(gè)，占所搜索到的微衛(wèi)星重復(fù)拷貝類別總數(shù)的93.32 %，而其他所有拷貝類別僅占6.68%。

3 討論

本研究利用微衛(wèi)星搜索軟件，對普通鸕鶿基因組微衛(wèi)星序列的種類、數(shù)量等分布特征進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析。1.0 Gb的普通鸕鶿基因組序列中搜索到135 498個(gè)不同類型重復(fù)序列，總長度約為2 304 711 bp，占到整個(gè)基因組序列長度的0.23% 。與牛Bostaurus(4.7%)[24]，綿羊Ovisaries(4.8%)[24]，北極熊Ursusmaritimus(0.79%)[25]，大熊貓Ailuropodamelanoleuca(0.64%)[25]等多種哺乳動(dòng)物基因組中相比，微衛(wèi)星序列在普通鸕鶿基因組中分布相對較少。但與綠尾虹雉Lophophoruslhuysii(0.54%)[26]，紅原雞Gallusgallus(0.49%)[27]，虎皮鸚鵡Melopsittacusundulatus(0.41%)[1]等多種鳥類基因組中相比，微衛(wèi)星序列在普通鸕鶿基因組中分布相差不大，這或許與哺乳動(dòng)物基因組重復(fù)序列較多且較大有關(guān)。

表2 1—4堿基重復(fù)類型中各重復(fù)拷貝類別數(shù)量及其在所屬類型中的比例

Tab.1 The number of repeat copy categories and the percent in their own types in 1-4 bp repeats

續(xù)表2

圖1 普通鸕鶿基因組中分布最多的不同重復(fù)拷貝類型微衛(wèi)星Fig.1 Distribution of the most frequent microsatellite motifs of Phalacrocorax carbo

不同物種基因組微衛(wèi)星的重復(fù)類型、數(shù)量、豐度、密度等都存在很大差別[28]。在所有的微衛(wèi)星重復(fù)類別中，單堿基重復(fù)類型所占的比例最高，為75.3%。這與牦牛(Bosgrunniens)[29]、紅尾蚺(Boaconstrictor)[30]、原矛頭蝮(Protobothropsmucrosquamatus)[30]等物種基因組中優(yōu)勢微衛(wèi)星類型相同。這一結(jié)果表明物種基因組中單堿基微衛(wèi)星類型重復(fù)偏多。其次是四堿基重復(fù)類型，所占的比例為7.8%。與二、三堿基重復(fù)類型相比，四堿基重復(fù)類型的微衛(wèi)星位點(diǎn)在PCR過程中，不容易出現(xiàn)陰影帶或滑帶，基因分型結(jié)果更精確、更穩(wěn)定，這一結(jié)果與紅原雞[27]和四川山鷓鴣(Arborophilarufipectus)[23]研究結(jié)果相同，進(jìn)一步支持了鳥類基因組具有四堿基微衛(wèi)星的偏好。

在單堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為(A)n的重復(fù)數(shù)目最多，為98 605個(gè)，所占比例為96.67%。這一結(jié)果與已進(jìn)行了全基因組微衛(wèi)星序列分析的大多數(shù)物種的研究一致，這表明微衛(wèi)星的分布對(A)n基具有偏好性。在二堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為AC的重復(fù)數(shù)目最多，為5 206個(gè)，所占比例為55.39%，這與豬(Susscrofa)[31]、食蟹猴(Macacafascicularis)[32]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[33]二堿基AC重復(fù)數(shù)目的分布規(guī)律相同。CG重復(fù)拷貝類別最少，數(shù)目為21，占二堿基重復(fù)序列總數(shù)目的0.22%。一般認(rèn)為，堿基的滑動(dòng)有可能造成微衛(wèi)星產(chǎn)生，而AT之間的雙鍵比GC之間的三鍵較容易斷裂，因而可能導(dǎo)致CG重復(fù)拷貝類別較少。在三堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為AAT的重復(fù)數(shù)目最多，為2 667個(gè)，所占比例為30.26%，與綠尾虹雉[26]基因組中AAT的重復(fù)數(shù)目最多相同，然而蝦虎魚科(Gobiidae)[34]以ACT 重復(fù)拷貝類別最多，中華按蚊(Anophelessinensis)[35]中含有較多的AGC，由此可以看出，微衛(wèi)星分布規(guī)律在不同物種中是有差異的。在四堿基重復(fù)類型中，拷貝類別為AAAC的重復(fù)數(shù)目最多，為3 275個(gè)，所占比例為30.74%，其次是AAAT重復(fù)拷貝類別，數(shù)目為1 950，占四堿基重復(fù)序列總數(shù)目的18.30%。這一結(jié)果與藏羚羊(Pantholopshodgsoni)[36]、德國小蠊(Blattellagermanica)[37]、食蟹猴[32]的研究結(jié)果一致。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，微衛(wèi)星越來越受到重視，如在瀕危動(dòng)物保護(hù)[38]、異地保種[39]方面，通過對普通鸕鶿微衛(wèi)星DNA的分布規(guī)律的分析，一方面了解了普通鸕鶿微衛(wèi)星的分布特點(diǎn)，另一方面也為研究微衛(wèi)星在基因組中的功能奠定了基礎(chǔ)。了解普通鸕鶿中微衛(wèi)星分布的特點(diǎn)，即為普通鸕鶿遺傳多樣性、物種保護(hù)、建立完整的遺傳背景資源庫以及不同物種微衛(wèi)星的比較分析等方面提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。