陳 蓉 呂 冉 程家求 傅兆水

(南京市紅山森林動物園管理處，南京，210028)

黃頰長臂猿(Nomascusgabriellae)隸屬長臂猿科(Hylobatidae)，冠長臂猿屬，僅分布于老撾南部、柬埔寨東部、越南中部和南部的低地森林，主要以植物的果實、樹葉、嫩枝、花朵為食，也兼食少量的昆蟲、鳥卵。因受棲息地喪失和狩獵因素的威脅，野生黃頰長臂猿數量不斷減少，已被IUCN列為瀕危種。目前，關于黃頰長臂猿微衛(wèi)星的研究尚未見報道，多數圈養(yǎng)黃頰長臂猿種群存在親緣關系模糊、譜系不精確等問題，不利于遷地保護，更不利于遷地保護向就地保護轉變。本研究通過對黃頰長臂猿微衛(wèi)星位點進行篩選，對南京紅山森林動物園圈養(yǎng)的14只黃頰長臂猿進行親緣關系分析，了解個體間的親緣關系和群體的遺傳多樣性情況，從而促進黃頰長臂猿物種保護的有效、科學、可持續(xù)地發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

實驗對象為南京市紅山森林動物園14只經物種鑒定的黃頰長臂猿，其基本信息見表1。采集其毛發(fā)，并保存于-20 ℃。

表1 14只黃頰長臂猿基本信息

Tab.1 The basic information table of 14 Nomascus gabriellae individuals

注：22、25、26、40、43、48、51、110均為譜系號

Note：Numbers 22，25，26，40，43，48，51 and 110 are pedigree numbers

1.2 主要試劑與儀器

微量基因組提取試劑盒、TaqPlus MasterMix、D2000 DNA Marker、GeneGreen核酸染料購自天根生化科技(北京)有限公司。普通引物均有金斯瑞生物科技有限公司合成。熒光引物合成和測序均有上海英濰捷基生物技術公司。

梯度PCR儀購自杭州龍揚儀器公司。凝膠成像系統(tǒng)購自上海歐翔儀器公司。水平電泳儀購自北京君意東方有限公司。高速冷凍儀離心機購自上海滬粵明科學儀器有限公司。

1.3 基因組DNA提取

按微量基因組提取試劑盒說明書提取長臂猿毛囊中的基因組DNA。提取后的基因組DNA樣本于-20 ℃保存，備用。

1.4 引物篩選與PCR

以微衛(wèi)星標記的序列重復單位、雜合度、多態(tài)信息含量和片段大小等特性為依據，從相近物種[1-2]和NCBI數據庫里篩選25個位點。梯度PCR反應體系為：Mix 12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物0.5 μL，雙蒸水6.5 μL，DNA模板5 μL。梯度PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94℃ 1 min，49 ℃—60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

以黃頰長臂猿大黑個體 DNA 為模板來檢測每個微衛(wèi)星位點的最佳PCR 擴增條件，挑選出多態(tài)性較高、擴增效果最好的微衛(wèi)星位點用以開發(fā)熒光PCR體系。

1.5 熒光引物的篩選

將多態(tài)性高、擴增條件好的微衛(wèi)星位點，相應引物的上游引物5′端分別用FAM，HEX，TAMRA 3種熒光染料進行標記。參考普通PCR的反應體系與反應條件，進行熒光標記引物的PCR擴增。

將PCR擴增產物避光保存于-20 ℃，依事先組合等量混合同一個體的PCR產物，低溫運輸，分3次送至上海英濰捷基生物技術公司進行SSR分型檢測。根據SSR分型檢測報告，根據每個圖譜峰值的位點位置和大小、片段大小，同時判斷純合子(單峰)或雜合子(雙峰)，挑選出適合的微衛(wèi)星位點。

1.6 統(tǒng)計分析

通過Cervus 3.0軟件進行遺傳多樣性和親緣系數分析數據分析，統(tǒng)計參數主要包括等位基因數(analyze the number of alleles，Na)，觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)，期望雜合度(expected heterozygosity，He)，多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)，無效等位基因頻率(null allele frequency，F(Null))，哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢測，親緣系數等。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星位點的篩選

25對微衛(wèi)星引物的梯度PCR擴增結果表明，有17對擴增出目的片段。對這17對引物進行熒光標記的PCR擴增，并進行SSR分型檢測，結果顯示僅11對熒光引物擴增出來的圖譜峰值的位點位置和大小、片段大小是正確的，其余6對出現錯峰、位點較多不符合孟德爾定律等情況。因此，采用這11對微衛(wèi)星引物進行黃頰長臂猿的親子鑒定。具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物序列、反應條件見表2。

表2 11對黃頰長臂猿微衛(wèi)星特征

Tab.1 Characterization of 11 polymorphic microsatellite loci for Nomascus gabriellae

2.2 遺傳多樣性分析

將11對英光引物的PCR產物送至上海英濰捷基生物技術公司進行檢測，結果11個微衛(wèi)星位點，共檢測出41個等位基因。運行Cervus 3.0中的Allen Frequentcy Analysis程序，得到11個微衛(wèi)星位點在14只個體中的遺傳信息參數(表3)。結果表明，平均等位基因數(K)為3.7，多態(tài)信息含量(PIC)為0.175—0.701，平均多態(tài)信息含量為0.463，屬于中度多態(tài)位點(0.25

表3 11個微衛(wèi)星位點在14只黃頰長臂猿中的遺傳信息參數分析

Tab.3 Analysis of genetic information parameters of 11 microsatellite loci in 14 Nomascus gabriellae individuals

注：K為位點等位基因數；N為基因分型的個體數：Ho為位點觀測雜合度；He為位點期望雜合度；PIC為位點多態(tài)信息含量；NE-1P為第一個親本的排除概率；NE-2P為第二個親本的排除概率；NE-PP為雙親的排除概率；F(Null)為無效等位基因頻率

Note：Kis allele number of loci，Nis number of genotyping，Hois observed beterozygosity，Heis expected heterozygosiry，PICis polymorphic information content，NE-1Pis exclusion probability of the first parent，NE-2Pis exclusion probability of the second parent，NE-PPis exclusion probability of the parent pair，F(Null)is frequency with null

2.3 親緣系數

通過Cervus 3.0軟件進行親緣系數結果見表4。已知大黃家族中，父本為大黑，子一代分別為園園、冬至、樂樂、夏天。其大黑與園園、冬至、樂樂、夏天的親緣系數分別為0.476 1，0.476 5、0.556 8、0.506 2；其子代間親緣系數為0.261 9—0.754 5。另一已知家族中，母本為黃婆，父本為園園，子代為恩奇。其母子親緣系數為0.452 6，父子親緣系數為0.452 6，親本間親緣系數為0.133 2。這些數值符合已知的譜系記載情況。

通過親緣系數分析，小黃與黃婆(0.326 7)、六華(0.422 7)親緣系數大于0.25，但均為雌性。迪克與冬至(0.453 3)、小小(0.310 7)、小四(0.353 1)、園園(0.267 0)親緣系數大于0.25，但均為雄性。黃婆與三兮(0.462 8)、小四(0.438 3)親緣系數大于0.25，其中與小四為異性。三兮除與黃婆外，還與九九(0.599 9)、恩奇(0.266 6)、大黑(0.360 2)親緣系數大于0.25。小小除與迪克外，還與冬至(0.391 5)、恩奇(0.319 7)親緣系數大于0.25。大黑與小四的親緣系數為0.712 9。小四除了小黃、六華外，與其他黃頰長臂猿的親緣系數都大于0.25。

3 討論

PIC可以作為衡量基因變異程度高低的指標，其值越大，說明這個群體中在該座位上雜合子比例越大，能提供的遺傳信息就越多。雙親在該位點雜合度越高，則其后代中越能夠清楚地觀察到等位基因的分離。在遺傳連鎖分析中，當該位點的PIC大于0.7時，說明該位點為理想的選擇標記。本研究所采用的11個座位的多態(tài)信息含量(PIC)為0.175—0.701，平均多態(tài)信息含量為0.463。其中，4個位點為高度多態(tài)，4個位點為中度多態(tài)，3個位點為低度多態(tài)。由此可見，這11個微衛(wèi)星位點可以作為評判這群黃頰長臂猿群體遺傳多樣性的有效遺傳標記。

表4 14只黃頰長臂猿的親緣系數(r)結果

Tab.4 Affinity coefficient(r)results of 14 Nomascus gabriellae individuals

該群體11個微衛(wèi)星位點共獲得等位基因41個，平均等位基因數(K)為3.7，多態(tài)信息含量(PIC)為0.175—0.701，平均多態(tài)信息含量為0.463，屬于中度多態(tài)位點(0.25

此次，個體之間的親緣關系較近，追蹤原有的譜系記錄，發(fā)現大部分黃頰長臂猿來自同一地區(qū)，同時我國圈養(yǎng)種群存在數量較少、配對少、繁殖難等問題，導致該圈養(yǎng)黃頰長臂猿小種群的親緣關系較近。在瀕危小種群物種管理中，奠基者效應造成的遺傳漂變較為常見，如我國的朱鹮(Nipponianippon)種群[5]、華南虎(Pantheratigrisamoyensis)種群[6]等。但是在有條件的情況下，盡量選擇親緣較遠的配偶進行繁殖，同時在引進新的血緣時，要結合遺傳學檢測，從而更加科學地進行物種管理。