何 鑫 王福云 張秀秀 朱 巖

(杭州動物園，杭州，310008)

圈養(yǎng)野生動物的生存環(huán)境與野外有較大的差異，除了受限制的空間、游客的干擾外，還有一些如動物的運輸、醫(yī)療、健康檢查等必要常規(guī)的管理手段，而這些管理手段對野生動物來說都是一種脅迫(stress)[1]，嚴(yán)重的會引起動物強烈的應(yīng)激，甚至導(dǎo)致死亡。近年來，正強化行為訓(xùn)練(positive reinforcement training，PRT)作為一種社群關(guān)系豐容手段，開始運用于圈養(yǎng)動物的飼養(yǎng)管理[2-3]。研究表明，通過適當(dāng)?shù)男袨橛?xùn)練，對減少黑猩猩(Pantroglodytes)的刻板行為和壓力水平有顯著的作用[3-4]；另一方面，也能減少保育人員受動物襲擊引起的傷害事故[5]。國內(nèi)相關(guān)動物訓(xùn)練研究也相繼在猩猩(Pongopygmaeus)[6]、赤大袋鼠等(Macropusrufus)[7]、非洲象(Loxodontaafricana)[8]等動物上開展。

黑葉猴(Trachypithecusfrancoisi)別名烏猿，屬靈長目(Primates)猴科(Cercopithecidae)疣猴亞科(Colobinae)，主要分布于中國的廣西、貴州及重慶。列為中國Ⅰ級重點保護動物。自20世紀(jì)90年代至今，由于棲息地縮減及人為影響，野外數(shù)量急劇下降，目前野外種群數(shù)量約為1 700余只[9]。截至2017年圈養(yǎng)種群為342只個體[10]。以前已針對野外黑葉猴開展分布、食性、活動節(jié)律等方面的研究[11-14]，針對籠養(yǎng)黑葉猴，集中在行為、生殖生理、營養(yǎng)等方面[15-18]，并未有針對黑葉猴的訓(xùn)練記錄，也未曾針對正強化訓(xùn)練對動物的生理影響展開研究。

代謝組(metabolome)技術(shù)是近二十年發(fā)展起來的研究技術(shù)，主要關(guān)注機體的代謝終產(chǎn)物[19]。通過代謝產(chǎn)物的變化，可進(jìn)而推導(dǎo)潛在代謝過程的改變，因此代謝組已被用于評價環(huán)境刺激對機體生理代謝過程的影響。在以大鼠為模型，采用代謝組手段研究抑郁癥與代謝產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)性中發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的產(chǎn)生可能與機體糖代謝的異常有關(guān)。其中，甘氨酸、谷氨酸、果糖、檸檬酸和葡萄糖和棕櫚酸可以作為生物標(biāo)記物，為診斷和治療抑郁癥提供定量依據(jù)[20]，而針對野生動物代謝組研究卻幾乎為零。

杭州動物園目前飼養(yǎng)2只黑葉猴，其中成年雄性“大杭”個體年齡較大，需要定期做體檢。因此對該動物個體進(jìn)行正強化訓(xùn)練，訓(xùn)練目標(biāo)是肌肉注射。本實驗在2018年6—8月間進(jìn)行，對籠養(yǎng)的黑葉猴進(jìn)行30 d的正強化的訓(xùn)練，希望通過代謝組分析了解行為訓(xùn)練對動物生理的影響，為進(jìn)一步找到合適的動物福利標(biāo)記物提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 研究對象

以杭州動物園飼養(yǎng)的1只黑葉猴為研究對象，呼名是“大杭”。個體與另一雌性個體飼養(yǎng)在一間籠舍?；\舍大小為7 m×8 m×5 m，籠舍面向游客的一面為玻璃，其余兩面為鋼筋鐵絲網(wǎng)結(jié)構(gòu)。水泥地面，有假山石塊、鋼管、木棲架及消防繩索的豐容設(shè)施?；\內(nèi)后方有1.5 m×1 m保溫用籠箱，內(nèi)有油汀。供動物夜間休息，躲避風(fēng)雨，防寒保暖用。喂食時間為每天的10：00及15：00。食譜包括樹葉、雞蛋、饅頭、玉米、水果、紅棗、花生等?；ㄉ鸀閯游镙^喜愛吃的食物。在訓(xùn)練時，將花生從飼料中挑出，作為強化物單獨喂食。實驗期間，大杭的飼料種類和數(shù)量保持不變。每天進(jìn)食時，將大杭隔離，飼料進(jìn)食完畢后，再將大杭放回社群。在實驗期間，大杭未發(fā)生疾病等情況。

1.2 正強化訓(xùn)練

對大杭進(jìn)行正強化訓(xùn)練，訓(xùn)練的目標(biāo)為肌注。訓(xùn)練的方法為正強化刺激，強化物為花生。橋接信號為響片聲。具體步驟見圖1，整個訓(xùn)練過程均由一名保育員完成。每天的訓(xùn)練時間為喂食前30 min，訓(xùn)練完畢后進(jìn)行日常飼料的飼喂。訓(xùn)練內(nèi)容詳見表1。

圖1 正強化訓(xùn)練步驟Fig.1 The steps of positive reinforcement training

表1 黑葉猴訓(xùn)練項目

Tab.1 Training items for fran?ois’ langur

1.3 糞便的采集和測定

1.3.1 樣品采集及提取

6月1日至8月1日，于隔天8：30采集2只個體的新鮮糞便，用封口袋裝好后，帶回實驗室，稱取1 g加疊氮化鈉后，于-70度保存。每個個體采樣20次。在室溫下解凍樣品后，向1.5 mL離心管里加入30 mg樣本及20 μL的內(nèi)標(biāo)液體(L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置)。再加入600 μL甲醇-水溶液(4∶1)，于-80 ℃下靜置2 min后再研磨2 min，離心(13 000 rpm，4 ℃，15 min)，吸取400 μL的上清液，裝入玻璃衍生瓶中，離心濃縮干燥器干燥樣品，向干燥物中加入80 μL的甲氧明鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg/mL)，37 ℃肟化反應(yīng) 90 min。取出樣品后再加入80 μL的BSTFA(含1%TMCS)衍生試劑和20 μL的正己烷，70 ℃反應(yīng)60 min。取出樣本后室溫放置30 min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。

1.3.2 GC-MS分析條件1.3.2.1 色譜條件

樣本用不分流模式注入GC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分析，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C，Agilent，USA)，進(jìn)樣量1 μL，經(jīng)氣象色譜柱(HP-5MS，Agilent J&W Scientific，USA)分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測，高純氦氣(6.0 mL/min)為載氣，進(jìn)樣口溫度280 ℃。升溫程序為：初始溫度60 ℃升至125 ℃(8 ℃/min)，至190 ℃(10 ℃/min)，再升至210 ℃(4 ℃/min)，最后至310 ℃(20 ℃/min)，維持8.5 min。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

采用隨機順序進(jìn)行連續(xù)樣本分析，電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，經(jīng)全掃描模式掃描(SCAN，m/z 50—600)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

個體采樣20次。將大杭訓(xùn)練前的采樣組為AT1組，訓(xùn)練之后為AT2組，每組10次采樣，進(jìn)行兩組比較和數(shù)據(jù)分析。通過統(tǒng)計學(xué)方法，分析每個樣本的代謝組信息。20個樣品的數(shù)據(jù)經(jīng)ChromaTOF軟件進(jìn)行預(yù)處理及歸一化，將整合后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+14.0，先采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)總體分布和整個分析過程的穩(wěn)定性，然后用有監(jiān)督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA來區(qū)分各兩組間代謝輪廓的總體差異，用(O)PLS-DA模型第一主成分的VIP值(VIP>1(Simca-P14.1))，結(jié)合P值(Pvalue<0.05(T-test))來尋找差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 糞便代謝輪廓分析

從典型總離子流圖中看出，大杭在訓(xùn)練前后的代謝物有明顯差異(圖3)。

圖2 黑葉猴糞便基峰強度色譜圖Fig.2 Typical fecal base peak intensity chromatogram in Dahang

2.2 偏最小二乘法分析(PLS-DA)

由AT1-AT2組的偏最小二乘法分析(PLS-DA)進(jìn)行模型分析，獲得3個主成分，R2y=0.951，Q2=0.502，得分如圖3所示。模型的解釋率R2y和預(yù)測率Q2較大，說明PLS-DA模型適合解釋兩組樣本間的差異。如圖3所示，兩組樣本處于得分圖的左右兩個區(qū)域，表示經(jīng)過30 d的行為訓(xùn)練后，大杭自身的糞便代謝物發(fā)生了顯著變化。

圖3 AT1-AT2的 PLS-DA的得分圖Fig.3 PLS-DA scores of fecal from group group AT1-AT2

2.3 (正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA

為了獲得導(dǎo)致兩組差異的更可靠的代謝物信息，用有監(jiān)督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA來過濾與模型分類不相關(guān)的信號，共得到3個主成分(R2y=0.95，Q2=0.454)，得分圖如圖4所示，模型的解釋率R2y和預(yù)測率Q2較大，表示(O)PLS-DA模型可靠。圖顯示兩組樣本分別處于第一主成分的兩側(cè)，表示兩組樣本(O)PLS-DA得分圖上有顯著的差異。

圖4 AT1-AT2的 OPLS-DA的得分圖Fig.4 OPLS-DA scores of fecal from group AT1-AT2

2.4 差異代謝物篩選

采用(O)PLS-DA第一主成分的VIP>1，結(jié)合P<0.05(T-test))的標(biāo)準(zhǔn)來尋找差異代謝物。通過與數(shù)據(jù)庫比較質(zhì)譜與色譜保留時間(RT)找到組間的差異代謝物(圖5)。通過分析，將差異代謝物進(jìn)行比對共概括出11種差異代謝物(表2)。

2.5 標(biāo)記物代謝通路分析

將差異代謝物信息映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫，可以獲得其富集到的KEGG 通路，KEGG富集結(jié)果如圖5，對P-value最小的前10個通路作圖，橫坐標(biāo)則為Pvalue取以e為底的負(fù)對數(shù)，-log(Pvalue)值越大，通路顯著性越高。

表2 大杭糞便差異代謝物

Tab.2 Differential fecal metabolites in Dahang

圖5 A-B組的差異代謝物富集通路Fig.5 Metabolite pathway in the A-B group

通過代謝分析，我們可以得出，行為訓(xùn)練引起的代謝物變化通路主要有嘧啶代謝、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成及分解，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝，半胱氨酸、蛋氨酸代謝。

3 討論

行為訓(xùn)練作為一種豐容的方式對動物的行為方式有一定影響，如異常行為和與壓力有關(guān)的行為降低，社會行為顯著增加[4]。但行為訓(xùn)練對野生動物的生理作用并不太明確，皮質(zhì)醇作為一種壓力激素，與動物所受的壓力狀況有關(guān)，因此也用來評價環(huán)境豐容的有效性及與刻板行為的關(guān)系。但皮質(zhì)醇還受到其他因素的影響，并不單一指示壓力大小。在本研究中，我們初步探討了采用GC-MC代謝組手段獲得的與行為訓(xùn)練相關(guān)的差異代謝物質(zhì)，且發(fā)現(xiàn)這些代謝物與氨基酸、脂質(zhì)及核酸等多條通路有關(guān)。

在氨基酸代謝方面，絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸代謝均下調(diào)。眾多研究表明，氨基酸代謝與動物壓力水平密切相關(guān)[21-23]。特別是甘氨酸已被明確報道為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量減少可間接反映動物運動量增加，飲食增加或機體代謝提高[24]。

亮氨酸、異亮氨酸均為動物必需氨基酸，對機體具有重要的作用，對食欲、營養(yǎng)吸收及肝腎功能，氧化功能，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)機體免疫功能。本研究結(jié)果顯示，“大杭”的相關(guān)代謝通路上調(diào)變化，進(jìn)一步說明行為訓(xùn)練可能提高了動物的運動傾向性，改善了其呆板行為的發(fā)生情況。該機制可能伴隨行為訓(xùn)練提高了動物的新陳代謝，間接提高對其的有關(guān)合成代謝[25]。此外，半胱氨酸與動物心血管系統(tǒng)疾病和應(yīng)激狀態(tài)均有關(guān)。

核酸和能量代謝方面，本研究表明，丙二酸、嘧啶、肌苷、乳糖代謝在行為訓(xùn)練動物上得到顯著增強，表現(xiàn)為其降解增強和糞便中相關(guān)產(chǎn)物含量的顯著降低。該結(jié)果與謝亮[25]在應(yīng)激猴模型中的研究結(jié)果相類似。研究報道，大鼠處于慢性壓力狀態(tài)下時，通過代謝組手段檢測其血清代謝物含量時，其中的葡萄糖和肌酸的含量顯著提高[26]。這可能由于壓力狀態(tài)減低了動物的糖代謝水平。特別是丙二酸為三羧酸循環(huán)的重要代謝產(chǎn)物，其水平顯著降低可能是由于動物機體經(jīng)過行為訓(xùn)練后，主動行為得到了強化，從而需要更多能量參與機體運動，最終提高了機體的有氧代謝過程，導(dǎo)致丙二酸等中間產(chǎn)物含量的降低。本研究結(jié)果提示，行為訓(xùn)練可能通過調(diào)控動物機體的能量代謝影響動物的行為。

本研究發(fā)現(xiàn)油酸和八碳脂肪酸酯的含量在訓(xùn)練動物上顯著提高。上述兩種物質(zhì)均屬于脂肪酸，研究表明，脂肪酸的含量可直接影響動物的行為狀態(tài)。如Zhang等[26]的研究表明，飽和脂肪酸可影響膽固醇和脂蛋白水平，并間接區(qū)分動物行為狀態(tài)。謝亮[25]研究發(fā)現(xiàn)，抑郁食蟹猴(Macacafascicularis)尿液代謝組分析中明顯伴有脂肪酸代謝方面的紊亂和飽和脂肪酸水平的升高。本實驗使用花生為強化物方法，花生為動物日常飼料，但因訓(xùn)練前，花生的供應(yīng)是通過帶殼花生的供應(yīng)，動物對花生的利用率可能不高，存在浪費。而訓(xùn)練后，將這部分花生剝出，全部由訓(xùn)練員飼喂。因此可能相對增加了花生的攝入。從代謝物通路分析看出，通過行為訓(xùn)練后，最主要發(fā)生變化的代謝途徑為相關(guān)的核酸代謝和蛋白質(zhì)代謝，由于花生的代謝主要影響脂肪酸代謝，這可能也造成了代謝組中脂肪酸相關(guān)水平的提高，因此后續(xù)試驗需要進(jìn)一步驗證該類脂肪酸和行為訓(xùn)練間的聯(lián)系。