周陽 王桃桃 閆丹丹 王瑩瑩 施沁璇 孫麗慧 林鋒

（1.江蘇大學生命科學研究院，鎮(zhèn)江 212013；2.浙江淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水健康養(yǎng)殖重點實驗室，湖州 313001）

彈性蛋白（Elastin）是一種細胞外基質(zhì)，為組織和器官提供完整的結(jié)構，且具有高度交聯(lián)和不溶的性質(zhì)，可為許多脊椎動物組織提供彈性［1］。1973年，研究人員從缺乏銅的豬動脈中分離出水溶性彈性蛋白，其中含有大量的VPGVG重復氨基酸序列，后根據(jù)彈性蛋白的疏水區(qū)特性合成了一種含有重復氨基酸序列（VPGVG）的蛋白質(zhì)聚合物——類彈性蛋白（Elastin-like polypeptide，ELP），主要由五肽重復序列單元組成，其基本結(jié)構為Val-pro-gly-xaa-gly，縮寫為（VPGXG）n，其中“X”為除脯氨酸外的任何天然氨基酸可占據(jù)的客體殘基（脯氨酸替代可導致ELP失去可逆的熱相變功能）；n為五肽重復序列的次數(shù)［2］。

基于ELP標簽的可逆相變循環(huán)（Inverse transition cycle，ITC）是一種新型的重組蛋白非色譜分離純化技術，利用ELP融合蛋白的可逆熱相變特性，經(jīng)過重復多次ITC從可溶性全蛋白溶液中特異地分離出ELP融合蛋白。由于在基因水平上可精確地控制ELP氨基酸序列、分子量、空間折疊結(jié)構以及相應的生化性質(zhì)，同時ELP化學結(jié)構與天然彈性蛋白相似，本身具有良好的細胞相容性、并能夠在體內(nèi)自然降解成對生物體無毒的、內(nèi)源性的氨基酸，這種可人工控制的理化性質(zhì)和良好的生物相容性，使ELP在新型生物醫(yī)學材料的應用方面具備十分廣闊的研究前景。重點闡述了ELP相變特性及機理；ELP融合蛋白的設計；ELP融合蛋白對蛋白質(zhì)（多肽）活性影響；ELP標簽在蛋白質(zhì)純化、生物醫(yī)藥、生物工程、水凝膠及新興領域方面的應用；ELP最新研究進展及發(fā)展方向。

1 ELP相變特性及機理

1.1 ELP的熱相變特性

ELP對pH值、鹽離子濃度及溫度非常敏感，引起疏水-親水結(jié)構的轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為可反復發(fā)生可逆相變過程。ELP在低臨界溶液溫度下表現(xiàn)出快速的可逆相變性質(zhì)，該臨界溫度稱為相變溫度（Inverse temperature transition，Tt）。相變過程溫度響應跨界僅僅2-3℃。當溶液溫度低于Tt時，ELP聚合物鏈無序延伸，在水溶液中以單體形式溶解；當溶液溫度高于Tt時，ELP單體會聚集在一起，形成微米大小的可見顆粒，并從水溶液中析出。當溶液溫度再次下降到Tt以下時，ELP再次溶解在溶液中［3-4］。孫利慧［5］報道25 μmol/L的ELP30、ELP40和ELP50相變溫度分別為32.5、29.5、25.5℃。1.25 mol/L的NaCl分別使25 μmol/L的ELP30、ELP40相變溫度分別降至15.5℃和11℃。0.4 mol/L的（NH4）2SO4使25 μmol/L的ELP50相變溫度最低降至7.5℃。

1.2 ELP的相變機理

當溶液的溫度低于Tt，ELP呈松散無序，VPGXG中的Pro-gly是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構，而ELP中的極性基團通過氫鍵與水分子結(jié)合。同時在ELP疏水基團斥力的影響下，疏水基團與水分子之間的氫鍵鍵合作用得到加強，形成有序的水分子。當溶液溫度高于Tt，溫度逐漸上升，疏水性基團周圍的有序水分子之間的氫鍵被大大削弱，因此呈現(xiàn)無序狀態(tài)。另一方面，因為疏水基團之間的疏水性增強，在水溶液中會看到ELP多肽鏈從隨機無序的結(jié)構聚集形成有序的II型β-轉(zhuǎn)角結(jié)構［6］。短ELP衍生肽（一般1-5重復）已經(jīng)顯示出具有相似的溫度敏感的構象［7］，單個VPGVG單元可充當熱力學獨立單元，以進行溫度誘導的β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變。在可逆熱相變中，多肽和多肽間、溶劑和多肽間相互作用、末端的基團和電荷引起ELP鏈二級結(jié)構的明顯改［8］。

1.3 ELP的Tt影響因素

ELP的相變行為受摩爾數(shù)、分子量、普通溶質(zhì)、濃度及客體殘留類型等多種因素的影響?？妥鶜埢倪x擇將直接影響ELP的逆相轉(zhuǎn)變溫度，親水性客座殘基會增加ELP的Tt，而疏水性客座殘基會降低ELP的Tt。Trabbic-Carlson等［9］比較不同ELP融合蛋白的Tt發(fā)現(xiàn)，Tt的變化與融合伴侶的表面疏水性相關聯(lián)，第4位客座殘基與帶電荷側(cè)鏈的結(jié)合和在多肽鏈上分布也會引起Tt改變。

當客座殘基位置摻入可電離氨基酸時，ELP的LCST行為對pH敏感。Lin等［10］構建了兩個包含客體殘基的Glu或His的ELP系列，結(jié)果表明最低臨界相容溫度（Lower critical solution temperatur，LCST）行為在各自的pKa值附近對pH敏感，是可電離氨基酸質(zhì)子化或去質(zhì)子化的結(jié)果。當可電離的氨基酸帶有電荷時，由于總疏水性的降低，ELP顯示出更高的Tt值。在可電離殘基不帶電的pH值下，增加的疏水性導致較低的Tt值。Mills等［11］研究了5種不同的ELP-mCherry融合蛋白的溶液相變行為，闡明ELP電荷和疏水性對融合蛋白自組裝的影響。結(jié)果表明與不帶電的ELP的融合產(chǎn)生了最佳的周期性納米級排列；而正負電荷分布平衡的平衡電荷ELP沒有明顯的有序排列，在高濃度下是高度雙折射；ELP電荷特性比ELP塊的疏水性更能預測自組裝。因此，在設計ELP時可以直接通過選擇客座殘基的類型和頻率來設計含有不同Tt的ELP。ELP這種特性已用于開發(fā)具有可交聯(lián)賴氨酸和半胱氨酸殘基的ELP，并生成具有不同轉(zhuǎn)變溫度且能夠經(jīng)歷多個溫度誘導的轉(zhuǎn)變的ELP融合蛋白［12］。

對于分子量已知的ELP，在溶液中的濃度會影響其相變溫度，ELP濃度越高Tt越低［13］。鹽離子對ELP的Tt的影響遵循霍夫邁斯特離子序（Hofmeister series），陽離子：NH4+>K+>Na+>Mg2+>Ca2+>Mn2+>Cu2+；陰離子。

2 ELP融合蛋白的設計

根據(jù)ELP的Tt對多個變量敏感，可以精確設計不同組成和長度，因而具有特定相變溫度的ELP，并根據(jù)hofmeister series離子序列規(guī)律選擇合適的鹽離子進一步調(diào)節(jié)Tt。

2.1 ELP標簽的長度（n的重復數(shù)）

ELP融合蛋白的Tt隨著ELP的序列，大小和濃度以及融合伴侶的疏水性和水溶液的離子強度而變化。ELP的鏈長［14］和客座殘基［15］是影響Tt的兩個重要參數(shù)。疏水性客體殘基和鏈長越大，Tt越低；而親水性客體殘基和鏈長越小，Tt越高。選擇正確的ELP標簽對目的蛋白的分離純化條件和效率至關重要。Tt太高的ELP融合蛋白在加熱純化過程中易使目的蛋白變性失活，增加融合蛋白中疏水性氨基酸的比例能夠降低Tt，但疏水性過強的ELP在相變時會增加雜蛋白的含量。融合蛋白中過長的ELP標簽會降低目的蛋白的比例，從而降低目的蛋白的表達量［16］。所以，設計合適的ELP標簽，同時選擇合適的鹽離子和溶液溫度是優(yōu)化ITC分離純化條件以及提高效率的首要任務，開發(fā)在溫和條件下就能高效分離重組蛋的最短ELP標簽尤為重要。Meyer等［14］構建了n為20-330的ELP，然而ELP長度顯著性影響體系原子總數(shù)，實際使用n一般不低于20，建議ELP標簽的長度n為20-100。

2.2 ELP標簽與目的蛋白的相對位置

目前對于目標蛋白N端或C端的ELP標簽設計沒有固定的模式，取決于靶蛋白性質(zhì)。如果目標蛋白的表達水平很高，N端ELP標簽會干擾目標蛋白正常折疊，C端標簽設計可能更合適。ELP的翻譯要在目標蛋白翻譯后才開始，因此避免了對目標蛋白折疊的干擾。如果靶蛋白的表達水平相對較低，則設計靶蛋白N端的標簽，可以增加靶蛋白的可溶性表達，可能是通過和未折疊成熟的蛋白質(zhì)鏈之間的疏水作用，幫助了正確的目標蛋白質(zhì)折疊，并通過空間立體效應，防止目的蛋白折疊時中間態(tài)分子之間的集聚［17］。Cho等［18］構建表達protein-ELP（C-terminus）和protein-ELP（N-terminus）融合蛋白，結(jié)果表明protein-ELP融合蛋白表達量高于ELPprotein融合蛋白；此外細胞溶解液中可溶性protein-ELP的融合蛋白濃度高于ELP-protein融合蛋白。因此，純化標簽應優(yōu)先遠離蛋白質(zhì)的受體結(jié)合區(qū)域放置。如果后者遠離N-末端或C-末端，則可以使用任一末端。如果特定的生物藥物蛋白質(zhì)在C端或附近具有其結(jié)合表位，則ELP純化標簽這種優(yōu)選的單向定位可能成為一種限制因素，需要進一步研究。

3 ELP標簽對融合蛋白的影響

3.1 不改變?nèi)诤系鞍锥壗Y(jié)構及酶活

ELP融合蛋白能增加蛋白溶解性，維持其生物活性和物理性質(zhì)。Floss等［19］報道了scfv-ELP融合蛋白的表達可以達到非常高的水平，且ELP不影響完整抗體的裝配、折疊和抗原結(jié)合特性。角朊細胞和成纖維細胞增殖實驗表明，ELP-KGF融合蛋白仍保留了KGF和彈性蛋白的性能［20］。Phan等［21］將ELP與兩種禽流感H5N1抗原進行融合表達，結(jié)果顯示ELP作為融合標簽不僅增強H5N1抗原表達，且可以利用ELP純化目標蛋白；此外純化的ELP融合靶蛋白仍保留生物學活性。Verma等［22］將游離藥物阿霉素（Dox）與ELP融合表達，結(jié)果表明游離Dox和合成的短肽Dox具有相似的生長抑制百分比；同時ELP無細胞毒性且不改變Dox對BMG-1腦膠質(zhì)瘤細胞系的功能活性。Heidari-Japelaghi等［23］將人干擾素-γ（Human interferon-γ，hIFN-γ）和ELP融合得到融合蛋白，獲得了高純度和高產(chǎn)量hIFNγ-ELP，hIFN-γ-ELP可溶性增加，三輪ITC純化可將hIFN-γ-ELP的總純度提高到98.5%。同樣，他們報道ELP與hIFN-γ融合，在煙草植株中瞬時表達。ELP融合可溶性增加，三輪ITC純化后hIFN-γ-ELP的總純度提高到98.2%。體外活性測定表明ELP對hIFN-γ折疊和生物活性沒有干擾作用［24］。Wang等［25］將IFN分別和ELP標簽和His結(jié)合，與IFNα-His不同，IFNα-ELP和ELP-IFN在20℃下主要表達為可溶性蛋白。

3.2 增加蛋白穩(wěn)定性

提高蛋白的穩(wěn)定性主要包括提高酶的熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、抵御酶失活和延長酶的半衰期。

3.2.1 增加蛋白熱和化學穩(wěn)定性 ELP融合蛋白可以增加蛋白的穩(wěn)定性。為了增強蛋白質(zhì)對變性劑和氧化劑的抗性與穩(wěn)定性，生物高聚物可以與酶融合以保護它們不被分解，同時在較長時間內(nèi)保持其分子完整性。Liu等［1］將膠原樣多肽（Collagen like protein，CLP）與ELP融合，再分別與超氧化物歧化酶（Superoxde dismutase，SOD）和D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）融合，結(jié)果表明SOD-CLP-ELP和DAAO-CLP-ELP對尿素變性的抗性高于SOD和DAAO，H2O2對SOD-CLP-ELP和DAAO-CLP-ELP二級結(jié)構的侵擾作用明顯減弱。ELP不僅能與水分子形成氫鍵，還可以與其他ELP分子形成氫鍵［18］。ELP序列重復的越長，所含的氫鍵越多，這解釋了ELP融合蛋白熱穩(wěn)定性。Cho等［18］推測，與結(jié)構形成相關的氫鍵而非疏水性是穩(wěn)定ELP坍塌的關鍵因素。最近，我們構建并表達了β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-glu）和ELP融合蛋白（Glu-ELP-His，GEH），結(jié)果表明ELP標簽不影響β-glu的酶活、二級結(jié)構及動力學參數(shù)，同時顯著提高了β-glu的熱穩(wěn)定性和對變性劑（尿素）的抗性，表明ELP在高溫下形成的有組織的可逆粒子會限制共價連接的酶的運動，從而防止酶在高溫下形成不可逆聚集［26］。與不含ELP的酶相比，ELP融合酶對變性劑具有更高的穩(wěn)定性，表明變性劑與蛋白質(zhì)中的氨基酸競爭形成氫鍵，而不是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)內(nèi)氫鍵［26］。酶的固定化也可以提高酶的穩(wěn)定性，我們的研究進一步表明GEH的熱穩(wěn)定性相似于固定化β-glu［27］。

3.2.2 提高藥物的代謝穩(wěn)定性 ELP融合蛋白可提高藥物代謝穩(wěn)定性，延長藥物的半衰期，增加藥物在組織內(nèi)的停留時間，實現(xiàn)長效以減少給藥頻率［28］。Udo等［29］研究表明，ELP與治療性蛋白質(zhì)的融合比非ELP融合蛋白具有更長的血清半衰期。Hu等［30］報道ELP融合干擾素（Interferon alpha，IFN-α）可以增加IFN-α的循環(huán)半衰期、藥物代謝動力學和抗腫瘤效果。Huang等［31］構建腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）與ELP融合蛋白RGD-TRAIL-ELP，結(jié)果表明RGD-TRAIL-ELP的誘導凋亡能力是RGD-TRAIL的3倍，延長TRAIL循環(huán)半衰期，且對肝臟無顯著毒性。Sarangthem等［32］描述IL-4受體靶向肽（IL-4 receptor targeting peptide，AP1）與ELP聚合物融合結(jié)合增強腫瘤的積累和保留時間以及藥物偶聯(lián)物的穩(wěn)定性和抗腫瘤活性。將胰高血糖素樣肽-1（Ghcagons-like pepfide 1，GLP1）融合到ELP中，在體內(nèi)形成可生物降解的凝膠狀“貯庫”從而緩慢釋放藥物，葡萄糖的控制可持續(xù)長達數(shù)周［33］。Wang等［25］將IFN分別和ELP標簽和His結(jié)合，與游離IFN相比，IFNα-ELP和ELP-IFN血漿穩(wěn)定性顯著提高。Strohl等［34］證明ELP序列與小的治療蛋白的融合可使這些蛋白質(zhì)具有較大的水動力半徑，提高它們的半衰期。

4 ELP在生物工程上的應用

4.1 ELP在蛋白純化方面的應用

在不影響蛋白功能的情況下，通過離子強度或溫度來增強ELP融合蛋白聚集的能力分離純化目標蛋白。通過構建ELP融合蛋白，可逆的相變循環(huán)可以用于分離純化質(zhì)粒或酶。第一步是通過基因工程設計構建ELP與靶蛋白的融合蛋白，建立ELP融合蛋白體系；之后通過簡單的過濾或離心，可逆的相變循環(huán)純化融合蛋白。ELP融合蛋白的相變通常是通過加熱或加鹽來實現(xiàn)的；棄上清后，將ELP沉淀在預冷緩沖液中重新溶解，在相變溫度下重新溶解后ELP再次離心，上清液為含有目標蛋白的溶液。與目前常規(guī)色譜技術相比較，ELP具有純化成本低、操作簡單（只需要離心機）、不影響酶活性且可以增加酶穩(wěn)定性等優(yōu)點。

ELP與靶蛋白基因水平的融合使融合蛋白與ELP具有相同的刺激反應行為。Kang等［35］通過不同鏈長的ELP純化左聚蔗糖酶，結(jié)果表明，采用ELP的熱相變特性可以成功純化融合蛋白，與ELP融合后酶的活性保持不變。Meyer等［36］通過ELP融合標簽的相變特性純化硫氧還原蛋白，ITC純化的硫氧還原蛋白純度優(yōu)于組氨酸標記的親和層析。Floss等［37］將ELP融合與結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85B/ESAT-6（Tuberculosis Ag85B/ESAT-6，TBAg）融合，結(jié)果表明通過ELP的相變特性成功純化TBAg-ELP，且融合蛋白在ELP標簽的存在下，在轉(zhuǎn)基因煙草植物中的表達與游離TBAg相比有所增加。因為ELP融合蛋白系統(tǒng)非常穩(wěn)定，已用于煙草等植物表達系統(tǒng)的表達和純化，同時也主要用于純化大腸桿菌中產(chǎn)生的融合蛋白，從而形成了一套完整的帶有ELP標簽的重組蛋白質(zhì)的ITC分離純化體系［38］。

ELP標記的α-淀粉酶（α-amylase）與ELP融合構建了融合蛋白ELP-amy，在E.coli表達，比較ITC純化與非色譜（固相金屬親和色譜）。結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)ITC的純化產(chǎn)率與His標簽純化產(chǎn)率相當，且ELP標簽改善熱穩(wěn)定性和催化效率［39］。這與我們的研究結(jié)果相似：ITC純化效率相似于His標簽的鎳柱純化效率，且ELP標簽不影響β-glu的動力學參數(shù)，二級結(jié)構及酶活，顯著提高酶的穩(wěn)定性［26］。Wang等［25］也報道了將IFN分別和ELP標簽和His融合，結(jié)果表明ELP融合蛋白純化效率與His融合蛋白純化效率相當。

4.2 ELP在組織工程方面的應用

ELP是一種高度可定制的組織工程用途的支架聚合物，由于ELP來源于細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），非常適合向細胞和組織提供生物學相關的功能及類似ECM的環(huán)境［40-41］。此外，ELP是一種基因編碼的生物聚合物，在基因水平上控制相關參數(shù)，如鏈長、位置、設計、類型、組成、聚合物結(jié)構和交聯(lián)位點的數(shù)量［41］。同時，ELP被注射到需要移植的組織缺陷部位后可以連接一個生物相容性較好的交聯(lián)劑，使交聯(lián)復合物在溫度或者其他的誘導條件下形成具有良好機械性能的支架，使ELP溶液與細胞或者其他的生物活性物質(zhì)很好地交聯(lián)在一起，同時具有很好的生物相容性。此外，在ELP的重組合成過程中可將生物活性多肽嵌入ELP內(nèi)或附加到ELP末端，ELP重組蛋白可通過體內(nèi)的蛋白酶裂解肽進行降解，同時支架的降解速度也可以根據(jù)VPGXG進行調(diào)整［42］。

Zhang等［43］以溫度為29℃的ELP作為培養(yǎng)表面，在這些基質(zhì)上培養(yǎng)羊膜上皮細胞和間充質(zhì)細胞，結(jié)果表明該方法可制備多層細胞片。在體外ELPs聚合物培養(yǎng)的軟骨細胞和成體干細胞中，軟骨基質(zhì)不斷合成并能保持一定的形狀一段時間，這表明ELPs可提供合適的物理生化環(huán)境以促進軟骨細胞分化，支持軟骨基質(zhì)的合成，并作為軟骨修復的細胞外支架［44］。Atefyekta等［45］將抗菌肽（RRP9W4N）共價結(jié)合含有細胞粘附肽域（Cell-adhesive peptide domains，RGD）的ELP表面涂層。該涂層具有很高的抗菌作用，同時對人體細胞沒有影響，表明將AMPs共價結(jié)合到含RGD的ELP上是醫(yī)療器械抗菌涂層的極佳選擇。Bandiera等［46］將一種新的雙功能重組蛋白人類彈性蛋白樣多肽（Human elastin-like polypeptide，HELP）和膽紅素結(jié)合蛋白UnaG的融合產(chǎn)物HELP-UnaG。該工程產(chǎn)品除了提供蛋白質(zhì)生產(chǎn)的高產(chǎn)方法外，HELP還能創(chuàng)建功能性的固態(tài)3D矩陣，在完整培養(yǎng)基中直接檢測在細胞水平產(chǎn)生的膽紅素。

4.3 ELP在藥物載體方面的應用

精確控制ELP的序列、大小和刺激反應特性，為合理設計用于藥物傳遞的大分子載體提供平臺；ELP也可以設計成自組裝的納米級構建體，在生理條件下作為組裝的納米粒循環(huán)結(jié)構［47］，也可能觸發(fā)對外界溫度刺激的自組裝反應［48］。ELP的溫度響應行為也可使用在因為生理溫度引起的粘性凝聚層局部遞送治療劑，ELP庫可以釋放肽類ELP融合物、蛋白質(zhì)-ELP或其他化學非肽類藥物。在37-42℃之間ELP采用調(diào)節(jié)Tt作用于體外熱療以及藥物的傳遞治療實體瘤。溫度高于Tt時ELP會發(fā)生可逆轉(zhuǎn)化，形成不溶性聚集體細胞，通過胞吞而內(nèi)化，輕度熱療可使腫瘤部位血流量和血管通透性增加，促進藥物進入腫瘤部位［49］。

作為藥物載體，ELP在注射部位不會引起炎癥，對小鼠成纖維細胞無毒，不產(chǎn)生皮膚刺激性、溶血性、全身毒性和全身抗原性。Park等［50］在低溫敏感脂質(zhì)體（Low temperature-sensitive liposomes，LTSLs）中發(fā)現(xiàn)一種脂肪酸結(jié)合的具有生物相容性和高熱敏性的ELP，通過與半衰期為1 h的LTSLs相比，該方法制備的ELP-TSL在固體腫瘤中通過EPR積累可獲得5 h的血漿半衰期。Dragojevic等［51］將Dox與細胞穿膜多肽（Cell penetrating peptide，CPP）和ELP融合，構建CPP-ELP-Dox融合蛋白，該蛋白在生理溫度下可溶，在外部施加溫和溫熱時聚集在腫瘤部位。Kuna等［52］進一步研究ELP的大小和形狀如何影響其藥代動力學和生物分布，建立大小從25-110 kD不等ELP庫。結(jié)果表明血漿終末半衰期與聚合物大小成正比，器官的生物分布也與大小有關。腎臟累積了所有大小的最高ELP水平，其次是肝臟。Lee等［53］構建含有整合素刺激RGD配體（Integrin-stimulatory RGD ligands）的ELP融合蛋白（人工基質(zhì)多肽），與未處理的胰島相比，該人工基質(zhì)多肽包覆的胰島在移植前培養(yǎng)中顯示出更高的生存力和胰島素分泌能力，經(jīng)該人工基質(zhì)處理的胰島在腎移植小鼠維持血糖正常的時間比對照更長。最近，Ryu等［54］通過ELP融合dnMAML多肽，利用被動靶向和熱活性腫瘤靶向技術，dnMAML肽被有效地遞送至腫瘤組織，抑制腫瘤生長。

4.4 ELP在水凝膠方面的應用

由于ELP復單元序列中的客座殘基可以是任何氨基酸，所以改進ELP序列的空間十分寬廣。如用賴氨酸或者丙氨酸取代客座殘基，可在ELP鏈中插入一個活性位點，用如交聯(lián)或者肽段功能化等化學修飾，使交聯(lián)后的ELP可以形成了凝膠和薄膜［55］。ELP基水凝膠是最近的工程改造的構建體已經(jīng)在生物醫(yī)學中使用，編碼到其骨架中的獨特生物活性導致細胞粘附的增加，促進血管生成因子的釋放增強和隨后的內(nèi)皮細胞組織［56］。

此外ELP水凝膠還表現(xiàn)出色的生物相容性、非免疫原性、最佳的生物力學特性以及對不同刺激的反應能力。Flora等［57］將VEGF模擬肽（QK肽）通過化學方法結(jié)合到ELR的水凝膠中并注射入小鼠的后肢區(qū)域，可增強構建物中新的毛細血管的形成，體內(nèi)發(fā)現(xiàn)在QK水凝膠中獲得了功能性微脈管系統(tǒng)，為細胞存活和組織生長提供了促血管生成的環(huán)境，體外確認軟骨基質(zhì)的形成II型膠原蛋白但不存在I型膠原蛋白，提示透明軟骨形成。Paiva Dos Santos等［58］將Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）序列融合到ELP中，構建ELP-IKVAV和ELP-VKAIV，然后使這兩種融合蛋白與官能的聚乙二醇（PEG）反應形成水凝膠；結(jié)果表明比IKVAV序列的水凝膠上生長的神經(jīng)元的神經(jīng)突更長。這種功能化的ELP-IKVAV生物材料對神經(jīng)化的組織工程顯示出有趣的特性有巨大的應用價值。

4.5 ELP的新興應用

ELP在材料化學、糖化合物、抗菌涂層、納米復合材料、眼表面支架、生物成像和生物馬達等在許多新興領域也得到廣泛應用。

Malho等［59］利用聚丙烯酸（Polyacrylic acid，PAA）和ELP合成具有溫度敏感性和pH敏感性多功能纖維素納米晶體（Cellulose nanocrystals，CNCs），為CNCs應用提供了更多的可能。Ghosh等［60］將ELP與釕聚吡啶基（Ruthenium（II）polypyridyl）復合物偶聯(lián)，研究臨界轉(zhuǎn)變溫度以下和以上兩個相的所得共軛物的光物理性質(zhì)，為利用溫度控制生物聚合物的刺激響應特性提供可能性。Xiao等［61］將多糖與刺激反應性ELP結(jié)合制備熱敏性自組裝復合物，將溶液溫度提高到特定轉(zhuǎn)變溫度Tt后，所得的生物共軛物能夠自組裝成水溶液中定義明確的納米顆粒，為用于生物醫(yī)學應用的受生物啟發(fā)的刺激反應性自組裝提供了新穎的途徑。Wang等［62］將羅丹明（Rhodamine）標記ELP用來測試隱形眼鏡溫度相關性，結(jié)果表明ELP凝聚顯著調(diào)節(jié)了釋放曲線，保留了80%以上負載量，半衰期可達到4個月，非凝聚條件下僅為1-4 d。

Geng等［63］2018年設計了一個富含組氨酸的彈性蛋白樣多肽（HRELP）融合標簽，在E.coli中高效表達，SDS-PAGE后幾分鐘內(nèi)用保利試劑（Pauly’s reagent）特異性染色，利用pH位移介導ITC可以純化HRELPs和HRELP20-BMP2融合蛋白，表明所建立的HRELP可以作為一種多功能蛋白標記物，可以Pauly染色快速檢測，并通過pH觸發(fā)的ITC簡單純化。Joachim等［64］將昆蟲金屬蛋白酶抑制劑（Insect metalloproteinase inhibitor，IMPI）與ELP融合以促進產(chǎn)物的回收，通過攪拌器和曝氣級聯(lián)的補料分批工藝，以控制溶解氧，表明自聚合ELP標簽通過上游生產(chǎn)和下游加工的集成簡化整個流程。

Chen等［65］通過結(jié)合熒光分子來監(jiān)測ELP熱轉(zhuǎn)變，將誘導發(fā)光分子四苯乙烯衍生物TPE-COOH通過酰胺鍵與ELP結(jié)合形成ELP-TPE。由于ELP-TPE具有熒光強度高，水溶性好和出色的生物相容性等優(yōu)點，因此在生物成像方面具有巨大的潛力。Diehl等［66］使用ELP偶聯(lián)物來控制和探測生物馬達組件中的協(xié)同作用，設計一個多馬達模型系統(tǒng)，其中單體驅(qū)動蛋白-1（Kinesin-1）馬達錨定在人工蛋白質(zhì)支架上。ELP被插入支架內(nèi)基本亮氨酸拉鏈結(jié)構域之間，而互補酸性拉鏈與kinesin-1融合，這種設計可精確控制電動機的空間和彈性耦合。

5 ELP的發(fā)展方向及亟待解決的關鍵問題和技術

5.1 高效切除ELP標簽

近年來ITC技術研究領域又有新的研究成果，常規(guī)ITC技術需要化學反應或蛋白酶去除ELP標簽，Chilkoti［67］、Wood［4，68］和Chen［69］實驗室分別構建在靶基因C段融合內(nèi)含肽intein，能夠快速從靶蛋白中去除ELP標簽，然后通過另一個熱沉淀循環(huán)將其去除，這種方法避免昂貴的蛋白酶，簡化去除ELP過程。Stiborova等［70］利用化學修飾方法把能特異可逆結(jié)合靶蛋白的捕捉分子連接到ELP上，在細胞裂解液中，這種可循環(huán)利用的ELP-捕捉分子能選擇性地結(jié)合靶蛋白，后續(xù)接著常規(guī)ITC分離程序就能從細胞裂解液中分離出靶蛋白。除此之外，當復合蛋白溶液中ELP融合蛋白濃度在1 μm/L以下，向溶液中額外加入一些ELP單體分子來提高靶蛋白的分離純化效率。這是因為ELP熱相變特性與濃度相關，蛋白溶液中ELP總濃度越高，ELP融合蛋白發(fā)生相變時分子間疏水作用越強，沉淀效率就越高［17］。

5.2 開發(fā)乙醇/鹽誘導ELP沉淀

ELP提供了一種高效且高度可擴展的途徑，需要添加摩爾水平的鹽來沉淀，難以控制最終產(chǎn)物的鹽度。規(guī)避高鹽蛋白溶液問題的一種方法是利用在水/乙醇溶劑中的ELP溶解度。Mills等［71］開發(fā)乙醇誘導的ELP沉淀、純化和脫鹽帶有ELP標簽的蛋白，經(jīng)過一個周期的氯化鈉誘導沉淀，隨后一個周期的乙醇誘導沉淀，獲得了具有高純度和低鹽度的最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這種選擇性沉淀和脫鹽ELP標簽蛋白質(zhì)的新方法將能夠?qū)π枰獓栏窨刂凭彌_液條件的蛋白質(zhì)材料進行高通量篩選。

5.3 開發(fā)可應用的短ELP

短ELP由于其較高的逆轉(zhuǎn)變溫度而很少使用。將短ELP與形成三螺旋的膠原樣肽結(jié)合而成功克服了這一障礙。短至4個五肽基序，由此產(chǎn)生的彈性蛋白樣肽-膠原蛋白樣肽（ELP-CLP）生物綴合物意外地自組裝成納米級血小板，可能是通過形成雙層結(jié)構［72］。正如前面所述單個VPGVG單元可以充當熱力學獨立單元，進行溫度誘導的擴展β-轉(zhuǎn)彎轉(zhuǎn)變。Cao等［6］將ELP的β-轉(zhuǎn)角單引入兩親性肽來開發(fā)溫度響應性自組裝分子，開發(fā)出一種新型的自組裝肽。此類肽的自組裝行為受整體分子疏水性，電荷分布和溫度的影響，具有較高疏水性的分子表現(xiàn)出更好的自組裝能力，以形成長的纖維狀納米結(jié)構。

5.4 絲彈性蛋白樣多肽（Silk-elastin-like polypeptides，SELP）

SELP由ELP和絲綢樣多肽（Silk-like polypeptides）構成。SELP是仿生序列，具有重復基序（GAGAGS）n。SELP被廣泛應用在藥物傳遞和組織工程中。SELP通常被設計為基本單元［（GAGAGS）n-（VPGXG）m］。SELP自組裝由絲綢或兩個組分驅(qū)動，產(chǎn)生各種納米結(jié)構，包括納米顆粒、納米纖維、納米凝膠和水凝膠。與ELP相似，替換SELP中的X可以解決pH、離子強度、氧化還原、酶促刺激和電場帶來的新的動態(tài)刺激響應功能［73］。藥物被包裹在由絲狀嵌段制成的疏水核中，將載有藥物的SELP納米顆粒內(nèi)化到HeLa細胞中，并將DOX傳遞到細胞核中。納米粒子顯示出與游離藥物不同的傳遞途徑，且在體外對癌細胞具有增強的毒性，表明對于耐藥性癌細胞模型是一種有效傳遞方法［74］。

5.5 ELP應用亟待解決的關鍵問題和技術

盡管ELP在蛋白純化及藥物載體等方面顯示出巨大應用前景，但是還有以下問題值得進一步研究。（1）選擇恰當?shù)臉O性和疏水性客座氨基酸X，優(yōu)化出不同客座氨基酸殘基的排序和數(shù)量，篩選出最佳五肽重復序列單元；（2）ELP作為藥物載體雖然具有安全性，然而ELP在體內(nèi)的降解途徑和機理尚未有詳細研究；（3）如何提高ELP藥物材料的智能性，開發(fā)溫控、鹽控和pH控ELP藥物；（4）能夠有效控制ELP自組裝過程及自組裝形成納米顆粒的直徑大小；（5）作為藥物載體，提高ELP藥物靶向性，使其更加高效、特異識別靶向組織或細胞。中的應用越來越受到關注。此外，ELP已被融合到來源于絲、膠原、樹脂和卷曲線圈的各種自組裝蛋白質(zhì)/肽中。復雜的自組裝具有來自不同塊組件的組合物理化學特性系統(tǒng)已經(jīng)被構建。例如，由于定位效應，與單一結(jié)構域的ELP相比，ELP-膠原融合具有意想不到的低Tt的協(xié)同效應。精確控制ELP的設計有利于操縱它們對外界環(huán)境的刺激反應和其他物理功能特征，同時ELP可調(diào)的理化性質(zhì)、良好的生物相容性和獨特的機械/生物特性使ELP在生物學上具有廣泛的應用。

6 總結(jié)

大規(guī)模純化蛋白是分離純化目標蛋白關鍵，然而如何快速、高效地從宿主細胞中分離純化重組蛋白一直沒有好辦法。目前，親和層析法是重組蛋白分離純化的主要方法，該純化技術操作繁瑣，需要特定的試劑及設備，難以大規(guī)模運用。使用ELP標簽的ITC法是一種超相分離行為，可以觸發(fā)超相分離行為獲得高純度蛋白，使得融合蛋白的簡單分離純化成為可能。通過ITC純化可以提高大部分重組蛋白的溶解度、穩(wěn)定性和活性。在大腸桿菌中表達的融合蛋白具有良好的可逆溶解性，該方法可重復使用以提高ELP融合蛋白的純度。

近年來，由于生物聚合物ELP及其衍生分子具有良好的彈性、生物活性、長期穩(wěn)定性和自組裝性，其在水凝膠、組織工程、生物醫(yī)學和藥物傳遞系統(tǒng)