萬(wàn)智雙 熊 丁 曹 宸 (眉山市人民醫(yī)院，眉山 620010)

肝癌是一種頻繁發(fā)生于慢性肝臟疾病和肝硬化中的惡性腫瘤疾病，原發(fā)性肝癌在常被診斷出的癌癥當(dāng)中位居第六，并且是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)性死亡的第二大主要原因[1,2]。超過(guò)半數(shù)的肝癌新病例和死亡都發(fā)生在中國(guó)，其中最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類(lèi)型是肝細(xì)胞癌[3]。在中國(guó)所有的癌癥病例當(dāng)中，肝癌生存率最低，由于早期診斷的缺乏，當(dāng)診斷出肝癌時(shí)已經(jīng)到了晚期，不適合采用根治性手術(shù)治療[4]。因此，發(fā)現(xiàn)能特異性阻斷肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的靶向分子，對(duì)于肝癌的治療具有重要意義。

MicroRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度約18～22 nt的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[5]。miRNA在生物體內(nèi)的異常表達(dá)與諸多疾病都有著密切聯(lián)系，其中包括癌癥。迄今為止已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了miRNA在癌癥發(fā)展和藥物抗性中所起到的關(guān)鍵調(diào)控作用[6,7]。然而由于miRNA功能的復(fù)雜性，很多方面仍有待進(jìn)一步研究。在多篇文獻(xiàn)中均報(bào)道了miR-433-3p對(duì)包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌、膀胱癌等在內(nèi)的多種腫瘤的抑制作用[8-10]。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了miR-433-3p與有絲分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)的關(guān)系，以及miR-433-3p對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖、凋亡和遷移的調(diào)控，為miR-433-3p對(duì)肝癌的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青鏈霉素、Trizol提取液、RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶生物公司，lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，miR-433-3p mimic、陰性對(duì)照mimic、pcDNA3.1-MAPK8(pc-MAPK8)由廣州銳博生物公司合成，Primescript RT Reagent kit和SYBR PremixEX Taq II試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司，BCA試劑盒購(gòu)自廣州永諾生物公司，CCK8試劑盒、Hoechst試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司，所用引物由上海生工生物合成，MAPK8、增殖細(xì)胞核抗原(Prolifera-ting cell nuclear antigen,PCNA)、活化半胱天冬酶3(cleave caspase 3,cl-CASP3)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.1.2臨床樣本獲取 收集從2010年到2016年存檔于眉山市人民醫(yī)院的經(jīng)病理檢查確診為肝癌的石蠟包埋組織27例及癌旁組織27例，所有樣本獲取已取得患者家屬知情同意，研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721、HepG2、MHCC 97H、Hep3B肝癌細(xì)胞株和HL-7702人正常肝細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，采用含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)于37℃和5%CO2環(huán)境中。

1.2.2細(xì)胞分組和處理 將MHCC97H細(xì)胞分為空白對(duì)照(Control)組、陰性對(duì)照(negative control,NC)組、miR-433-3p組、pc-MAPK8組和miR-433-3p+pc-MAPK8組，根據(jù)對(duì)應(yīng)的組別，按照l(shuí)ipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)，陰性對(duì)照mimic轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞，miR-433-3p mimic轉(zhuǎn)染miR-433-3p組細(xì)胞，pc-MAPK8轉(zhuǎn)染pc-MAPK8組細(xì)胞，miR-433-3p mimic和pc-MAPK8共轉(zhuǎn)染miR-433-3p+pc-MAPK8組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-PCR檢測(cè) Trizol溶液提取各組樣品RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。按照SYBR PremixEX TaqⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)mRNA或miRNA轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 生物信息學(xué)的方法分析預(yù)測(cè)了miR-433-3p與MAPK8的靶向作用位點(diǎn)，構(gòu)建MAPK8 3′-UTR區(qū)域的pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型(MUT)載體，分別與miR-433-3p或陰性對(duì)照mimic共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48 h后檢測(cè)熒光素酶酶活性。

1.2.5Western blot檢測(cè) RIPA溶液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量，每孔30 μg上樣量進(jìn)行點(diǎn)樣，通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白印跡到PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h，使用一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS緩沖液清洗PVDF膜，加入二抗孵育2 h，滴加ECL顯色液進(jìn)行顯影，實(shí)驗(yàn)采用GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.6CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將按1.2.1處理的細(xì)胞于5%CO2，37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 d使用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖倍數(shù)，總共進(jìn)行3 d。具體測(cè)定方法為：細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入10 μl的CCK8試劑并培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光值。

1.2.7Hoechst檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6孔板，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5% TrintonX-100透膜處理，滴加Hoechst染料進(jìn)行染色30 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡。

1.2.8Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 50 μl基質(zhì)膠加入Transwell小室中37℃凝固3 h，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入完全培養(yǎng)基，各組細(xì)胞分別接種于Transwell小室上室，培養(yǎng)48 h。擦除未過(guò)膜的細(xì)胞，多聚甲醛固定殘余的細(xì)胞，使用1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色并拍照。

1.2.9劃痕愈合法檢測(cè)細(xì)胞遷移 細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞鋪滿(mǎn)板內(nèi)80%的空間時(shí)，中槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行垂直水平劃線，PBS清洗之后，在5%CO237℃的條件下培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察劃痕愈合情況。

2 結(jié)果

2.1肝癌細(xì)胞株中miR-433-3p表達(dá)下調(diào) 如圖1A所示，與正常肝組織比較，肝癌組織中miR-433-3p表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，如圖1B所示，與正常肝細(xì)胞株HL-7702比較，肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、HepG2、MHCC97H、Hep3B中miR-433-3p表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。選用了miR-433-3p表達(dá)量最低的MHCC97H細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)人臨床肝組織樣本和細(xì)胞株中miR-433-3p表達(dá)Fig.1 RT-PCR detection of miR-433-3p expression in human clinical liver tissue samples and cell linesNote: **.P<0.01 versus Normal & HL-7702 group.

2.2miR-433-3p抑制MAPK8 mRNA轉(zhuǎn)錄 如圖2所示，與Control組比較，NC組miR-433-3p表達(dá)水平無(wú)顯著差異，miR-433-3p組miR-433-3p表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)，與Control組比較，NC組MAPK8轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著差異，miR-433-3p組MAPK8轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 RT-PCR檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞中miR-433-3p對(duì)MAPK8轉(zhuǎn)錄的影響Fig.2 RT-PCR detection of effects of miR-433-3p on MAPK8 transcription in MHCC97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group.

2.3miR-433-3p靶向作用于MAPK8 如圖3所示，與MAPK8 WT+NC比較，MAPK8 WT+miR-433-3p組熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MAPK8 MUT+NC與MAPK8 MUT+miR-433-3p組不存在顯著的熒光素酶活性差異。

圖3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-433-3p和MAPK8的靶向作用關(guān)系Fig.3 Luciferase reporter assay for targeting relationship between miR-433-3p and MAPK8Note: n=3,**.P<0.01 versus MAPK8 WT+NC group.

2.4miR-433-3p抑制MAPK8表達(dá) 如圖4所示，與Control組比較，miR-433-3p組MAPK8蛋白表達(dá)顯著降低，pc-MAPK8組MAPK8蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與pc-MAPK8組比較，miR-433-3p+pc-MAPK8組MAPK8蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測(cè)MAPK8蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detection of MAPK8 protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

2.5miR-433-3p抑制肝癌細(xì)胞增殖 如圖5所示，與Control組比較，miR-433-3p組MHCC97H細(xì)胞增殖水平顯著降低，pc-MAPK8組細(xì)胞增殖水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與pc-MAPK8組比較，miR-433-3p+pc-MAPK8組細(xì)胞增殖水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 CCK8檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞增殖Fig.5 CCK8 detection of cell proliferation of MHCC 97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

2.6miR-433-3p誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡 如圖6所示，與Control組比較，miR-433-3p組MHCC97H細(xì)胞凋亡率顯著升高，pc-MAPK8組細(xì)胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與pc-MAPK8組比較，miR-433-3p+pc-MAPK8組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 Hoechst檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞凋亡Fig.6 Hoechst detection of cell apoptosis of MHCC 97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

2.7miR-433-3p抑制肝癌細(xì)胞遷移 如圖7所示，與Control組比較，miR-433-3p組MHCC97H細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低，pc-MAPK8組細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與pc-MAPK8組比較，miR-433-3p+pc-MAPK8組細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖7 劃痕愈合法檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞遷移能力Fig.7 Wound healing test of migration ability of MHCC 97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

2.8miR-433-3p抑制肝癌細(xì)胞侵襲 如圖8所示，與Control組比較，miR-433-3p組MHCC97H細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低，pc-MAPK8組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與pc-MAPK8組比較，miR-433-3p+pc-MAPK8組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖8 Transwell法檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞侵襲能力Fig.8 Transwell chamber test of invasion ability of MHCC97H cellsNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

2.9miR-433-3p對(duì)增殖、 凋亡及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控 如圖9所示，與Control組比較，miR-433-3p組MHCC97H細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)顯著升高，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白N-cadherin和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與pc-MAPK8組比較，miR-433-3p+pc-MAPK8組細(xì)胞中E-cadherin和Caspase-3蛋白表達(dá)升高，N-cadherin和PCNA蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖9 Western blot檢測(cè)增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.9 Western blot determination of proliferation,apoptosis and metastasis related protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus pc-MAPK8 group.

3 討論

有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)家族是一類(lèi)在細(xì)胞中扮演著重要調(diào)控作用的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族。促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、環(huán)境脅迫等因素產(chǎn)生的刺激經(jīng)過(guò)一系列激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，促使MAPK激活[11]。MAPK8又被稱(chēng)為c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)，是MAPKs家族的重要成員之一，可磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白1(activator protein-1,AP-1)，進(jìn)而激活下游一系列基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞生存、細(xì)胞死亡、炎癥及其他病理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[12]。在肝癌中，已有大量文獻(xiàn)表明MAPK8與肝癌具有密切的關(guān)系[13,14]，具有作為藥物治療靶點(diǎn)的潛力。而Tao等[15]的研究表明，在心肌中miR-433-3p可靶向作用于MAPK8與AZIN1，調(diào)控心肌纖維化的進(jìn)程，Yang等[16]報(bào)道了miR-433-3p可通過(guò)抑制cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(cAMP response element-binding protein 1,CREB1)的表達(dá)與功能，發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞遷移的作用。推測(cè)在肝癌細(xì)胞中miR-433-3p可能與MAPK8存在靶向作用，調(diào)控肝癌的發(fā)展。為了證實(shí)這一推測(cè)本文首先檢測(cè)了miR-433-3p在多種肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞株中miR-433-3p表達(dá)均發(fā)生下調(diào)，表明miR-433-3p可能參與了肝癌的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-433-3p與MAPK8存在靶向作用關(guān)系，并且miR-433-3p的高表達(dá)可顯著抑制MAPK8的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，結(jié)果表明在肝癌細(xì)胞MHCC97H中miR-433-3p可靶向作用于MAPK8，抑制MAPK8的表達(dá)。

不受控制的細(xì)胞增殖以及逃避凋亡的能力是癌細(xì)胞的主要特征之一，研究表明MAPK8對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖起著重要的調(diào)控作用。Hui等[14]報(bào)道了JNK1在肝細(xì)胞癌模型中可通過(guò)提高細(xì)胞增殖促進(jìn)基因c-Myc的表達(dá)，下調(diào)增殖抑制因子p21的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-433-3p顯著抑制了肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，MAPK8的過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p的作用。同時(shí)，miR-433-3p顯著提升了cl-CASP3的表達(dá)，抑制PCNA的表達(dá)，MAPK8過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一作用。PCNA可調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，參與了DNA復(fù)制所需的聚合酶的合成，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)；細(xì)胞凋亡主要是由Caspase家族蛋白介導(dǎo)的，cl-CASP3是細(xì)胞凋亡途徑的最主要的執(zhí)行蛋白[17,18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-433-3p可通過(guò)下調(diào)MAPK8表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

不受限制的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力是癌細(xì)胞的另一主要特征，其中遷移和侵襲在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。研究表明MAPK8同樣參與了對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。Tsai等[19]報(bào)道了甘草查爾酮A可通過(guò)下調(diào)MKK4/JNK信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)miR-433-3p顯著抑制了肝癌細(xì)胞MHCC97H的遷移和侵襲，MAPK8過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p的抑制作用。同時(shí)，miR-433-3p顯著提升了E-cadherin的表達(dá)，抑制N-cadherin的表達(dá)，MAPK8的過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p的調(diào)控作用。E-cadherin參與同類(lèi)型細(xì)胞的黏附連接作用，是維持上皮細(xì)胞形態(tài)的重要成分，N-cadherin則起著相反的作用，促進(jìn)細(xì)胞向間質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)變[20,21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-433-3p可通過(guò)下調(diào)MAPK8表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的遷移和侵襲。

綜上所述，miR-433-3p可靶向抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H中MAPK8的表達(dá)，提升cl-CASP3和E-cadherin的表達(dá)，抑制PCNA和N-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究首次探究了在肝癌中miR-433-3p通過(guò)靶向作用于MAPK8，對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，為肝癌的靶向治療干涉提供了新的參考。