尹 俊 莊 紅 黃 璐 蔣 偉 代 天 張?zhí)K川

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430000)

多糖類化合物在自然界動(dòng)植物中廣泛存在，其具有抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種功能[1,2]。柴胡(bupleurum)又稱山地蔬菜和草，是傘形科(umbelliferae)的多年生草本植物，主要含有柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油、脂肪油和多糖，具有疏散解熱、舒緩肝臟等功能[3,4]。多糖結(jié)構(gòu)是柴胡生物活性的基礎(chǔ)，其為柴胡的重要活性成分之一。因此柴胡多糖的功能研究對(duì)疾病的治療具有重要意義。本研究建立LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2損傷模型，觀察柴胡多糖對(duì)其細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激、炎癥因子分泌的影響，揭示其機(jī)制與調(diào)控MAPK/ERK5信號(hào)通路相關(guān)，為柴胡多糖的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 乳鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；柴胡飲片購(gòu)自成都荷花池中藥材市場(chǎng)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sellect公司；LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；PVDF膜購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海銳賽生物。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞模型的建立及分組 柴胡多糖的提取參考林浩等[5]的方法進(jìn)行提取，并配制成5、15、45、90 μg/ml 的含量，待用。參考劉丹等[6]的方法建立LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型；參考武劍[7]對(duì)柴胡多糖使用劑量的研究設(shè)置柴胡多糖(5、15、45、90 μg/ml)劑量組與模型組心肌細(xì)胞共培養(yǎng)處理48 h，分別標(biāo)記為5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml 柴胡多糖+LPS組。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞制成混懸液，調(diào)整密度至104個(gè)/ml，然后接種至96孔板，取100 μl細(xì)胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液上清，然后每孔加150 μl DMSO，振蕩使結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)。

1.2.3ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上清液中LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6的表達(dá) 按照LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6各自的檢測(cè)試劑盒要求檢測(cè)細(xì)胞中LDH、ROS、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6的表達(dá)。

1.2.4Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞，用 500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/FITC避光反應(yīng)20 min后再加入5 μl的PI避光反應(yīng)20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀結(jié)束檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MAPK、ERK5的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

2 結(jié)果

2.1不同濃度的柴胡多糖對(duì)LPS致心肌細(xì)胞活力的影響 結(jié)果如表1所示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞活力顯著降低，LDH含量顯著升高；5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組比LPS組，細(xì)胞活力均顯著升高，LDH含量顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞活力均顯著升高，LDH含量顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞活力均顯著升高，LDH含量顯著降低(P<0.05)。

2.2柴胡多糖減少LPS致心肌細(xì)胞ROS生成 結(jié)果如表2所示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞中ROS含量顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中ROS含量均顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中ROS含量均顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中ROS含量均顯著降低(P<0.05)。

GroupsCellviability(%/NC)LDH(U/L)NC100.00±0.00187.74±18.55LPS47.89±3.121)324.26±35.711)5μg/mlBPS+LPS56.66±3.862)283.43±32.462)15μg/mlBPS+LPS65.72±4.342)3)245.53±27.482)3)45μg/mlBPS+LPS73.86±5.822)3)4)201.86±24.122)3)4)90μg/mlBPS+LPS71.74±6.782)219.57±20.122)3)4)F140.15333.114P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

GroupsROS(U/ml)NC47.74±11.45LPS264.26±39.421)5μg/mlBPs+LPS193.43±16.352)15μg/mlBPs+LPS145.53±17.592)3)45μg/mlBPs+LPS87.86±13.822)3)4)90μg/mlBPs+LPS94.57±16.352)3)4)F71.519P0.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;Compared with LPS group,2)P<0.05;Compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；Compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

2.3柴胡多糖對(duì)LPS致心肌細(xì)胞MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影響 結(jié)果如表3所示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞中SOD、GSH-Px顯著降低，MDA含量顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中SOD、GSH-Px均顯著升高，MDA含量顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中SOD、GSH-Px均顯著升高，MDA含量顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中SOD、GSH-Px均顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

GroupsMDA(nmol/mgport)SOD(U/mgport)GSH-Px(U/g)NC9.89±1.1683.13±4.53835.27±105.78LPS37.14±3.581)41.39±2.331)395.12±39.611)5μg/mlBPs+LPS28.17±4.072)54.27±3.722)510.74±47.832)15μg/mlBPs+LPS22.53±3.862)3)65.39±3.422)3)633.45±53.272)3)45μg/mlBPs+LPS15.43±3.402)3)4)71.87±4.832)3)4)772.52±60.592)3)4)90μg/mlBPs+LPS15.29±2.682)3)4)73.46±3.462)3)4)781.24±59.722)3)4)F46.05765.13121.647P0.0000.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡Fig.1 Cell apoptosis was detected by flow cytometry

2.4柴胡多糖減少LPS致心肌細(xì)胞凋亡 結(jié)果如圖1和表4示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞凋亡率顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組凋亡率均顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組凋亡率均顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml 柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)。

2.5柴胡多糖減少LPS致心肌細(xì)胞TNF-α和IL-6的生成 結(jié)果如表5所示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞中TNF-α、IL-6均顯著升高；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中TNF-α、IL-6均顯著降低；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中TNF-α、IL-6均顯著降低；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中TNF-α、IL-6均顯著降低(P<0.05)。

GroupsCellapoptosisrate(%)NC6.59±0.81LPS21.35±1.931)5μg/mlBPs+LPS18.62±1.682)15μg/mlBPs+LPS15.73±1.542)3)45μg/mlBPs+LPS12.52±1.392)3)4)90μg/mlBPs+LPS12.46±1.432)3)4)F36.140P0.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

GroupsTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)NC24.89±7.4533.25±5.98LPS231.14±20.561)364.26±32.681)5μg/mlBPs+LPS182.17±18.192)253.43±18.272)15μg/mlBPs+LPS 135.53±14.462)3) 175.53±14.742)3)45μg/mlBPs+LPS 67.86±10.242)3)4) 77.86±8.832)3)4)90μg/mlBPs+LPS 79.38±8.742)3)4) 84.57±7.462)3)4)F89.661159.135P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

圖2 檢測(cè)心肌細(xì)胞中MAPK和ERK5的表達(dá)Fig.2 Detected expressions of MAPK and ERK5 in cardiac myocytes

GroupsMAPKERK5NC0.39±0.040.72±0.04LPS0.85±0.061)0.35±0.061)5μg/mlBPs+LPS0.67±0.072)0.53±0.052)15μg/mlBPs+LPS0.54±0.062)3)0.67±0.042)3)45μg/mlBPs+LPS0.36±0.042)3)4)0.79±0.062)3)4)90μg/mlBPs+LPS0.38±0.042)3)4)0.82±0.062)3)4)F41.13034.502P0.0000.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 5 μg/ml BPs+LPS group,3)P<0.05；compared with 15 μg/ml BPs+LPS group,4)P<0.05.

2.6柴胡多糖抑制心肌細(xì)胞MAPK和ERK5表達(dá) 結(jié)果如圖2、表6所示，與空白組相比，LPS組細(xì)胞中MAPK蛋白表達(dá)量顯著升高，ERK5蛋白表達(dá)量顯著降低；與LPS組相比，5 μg/ml柴胡多糖+LPS組、15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中MAPK蛋白表達(dá)量均顯著降低，ERK5蛋白表達(dá)量均顯著升高；與5 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，15 μg/ml柴胡多糖+LPS組、45 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中MAPK蛋白表達(dá)量均顯著降低，ERK5蛋白表達(dá)量均顯著升高；與15 μg/ml柴胡多糖+LPS組相比，45 μg/ml 柴胡多糖+LPS組、90 μg/ml柴胡多糖+LPS組細(xì)胞中MAPK蛋白表達(dá)量均顯著降低，ERK5蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。

3 討論

柴胡多糖是在中藥柴胡中提取的一種混合多糖，主要由以下6種多糖組成：D-木糖、核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖或L鼠李糖、L-阿拉伯糖，具有較強(qiáng)的抗?jié)?、抗病毒、增?qiáng)免疫力的作用[8]。王雪峰等[9]通過CVB3m感染建立小鼠心肌損傷模型，通過柴胡、黃芩提取物治療后發(fā)現(xiàn)，小鼠的死亡率明顯降低，并且小鼠的心肌組織有明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明柴胡、黃芩提取物對(duì)小鼠心肌損傷具有明顯的治療作用。劉建和等[10]發(fā)現(xiàn)，柴胡三參膠囊對(duì)缺血再灌注大鼠具有保護(hù)作用，其通過調(diào)控血清心肌酶和MDA的水平發(fā)揮作用。本研究通過LPS建立大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，運(yùn)用MTT法檢測(cè)柴胡多糖對(duì)受損心肌細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)柴胡多糖可呈濃度依賴性增強(qiáng)細(xì)胞活力，LDH含量顯著降低，說(shuō)明柴胡多糖對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用，這與前人的研究結(jié)果均相一致，但其發(fā)生作用的機(jī)制尚未十分清楚。

心肌損傷的機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及線粒體損傷等，其中氧化應(yīng)激和炎性損傷是最重要的病理過程[11,12]。韋迎娜等[13]在心肌炎的研究中報(bào)道，槲皮素可上調(diào)心肌炎乳鼠血清中SOD表達(dá)水平，下調(diào)MDA和LDH的表達(dá)水平，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、iNOS的表達(dá)水平，并且失活TGF/NF-κB信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎的保護(hù)作用，降低乳鼠的死亡率。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)柴胡多糖治療的心肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激因子ROS、MDA的含量明顯降低，SOD、GSH-Px的含量明顯升高，細(xì)胞核陽(yáng)性比率明顯降低，說(shuō)明柴胡多糖具有很好的抗氧化應(yīng)激功能；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，柴胡多糖治療的心肌細(xì)胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量均顯著降低，說(shuō)明柴胡多糖具有明顯的抗炎作用，這些結(jié)果揭示了柴胡多糖在心肌損傷中通過抗氧化應(yīng)激和抗炎作用發(fā)揮治療作用，為柴胡多糖在心血管疾病中的治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

MAPK途徑由一系列相關(guān)蛋白激酶組成，其中ERK1/2(MAPK3/MAPK1)受到最多關(guān)注[14-17]。然而，ERK5(MAPK7)與ERK1/2共享許多特性和一些功能，但在分析MAPK在癌發(fā)生中的作用和惡性腫瘤的治療方法時(shí)，容易忽略。另外，最近對(duì)ERK5在器官發(fā)育和細(xì)胞分化中的功能探索日益增多，尤其是ERK5在心血管發(fā)育過程中的功能[18]。Vassalli等[19]在缺血再灌注心肌損傷的研究中發(fā)現(xiàn)p38 MAPK異?；罨龠M(jìn)心肌炎性損傷。韋靈等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中MAPK 的mRNA和蛋白表達(dá)均發(fā)生上調(diào)，ERK5的mRNA和蛋白表達(dá)均發(fā)生下調(diào)，而經(jīng)過氧化苦參堿治療能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MAPK、ERK5的表達(dá)，說(shuō)明MAPK/ERK5信號(hào)通路在心肌損傷中具有重要作用。本研究通過Western blot檢測(cè)了LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MAPK、ERK5的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中MAPK蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，ERK5蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，這與前人的研究結(jié)果均一致，再次驗(yàn)證了MAPK/ERK5信號(hào)通路在心肌損傷中的重要性。深入研究發(fā)現(xiàn)，柴胡多糖可呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)心肌細(xì)胞損傷中MAPK、ERK5表達(dá)的影響，說(shuō)明柴胡多糖具有下調(diào)MAPK、上調(diào)ERK5的功能，推測(cè)柴胡多糖發(fā)揮作用的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MAPK/ERK5信號(hào)通路密切相關(guān)。綜上所述，柴胡多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌炎具有抗氧化和抗炎的功能，其機(jī)制與調(diào)控MAPK/ERK5信號(hào)通路相關(guān)，為柴胡多糖的臨床應(yīng)用提供參考。