尹西拳 梁 明 胡明華 羅 丹 丁劉剛 林曉亮 劉 衛(wèi)②

(無(wú)限極(中國(guó))有限公司，廣州 510663)

雞軟骨肽，是以動(dòng)物雞(Gallus gallus)的胸軟骨為原料，通過(guò)生物可控的酶解技術(shù)制備而得的多肽混合物。雞軟骨肽中富含關(guān)節(jié)軟骨所需的Ⅱ型膠原蛋白、硫酸軟骨素以及其他活性多肽，其對(duì)關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等關(guān)節(jié)和骨骼的退行性疾病具有防治作用[1，2]。有報(bào)道指出膠原蛋白肽可通過(guò)多種途徑發(fā)揮關(guān)節(jié)保護(hù)作用[3]，如：刺激關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生Ⅱ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸、黏多糖、蛋白多糖等活性物質(zhì)發(fā)揮修復(fù)作用；增加成骨細(xì)胞的數(shù)量和分化；減少破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收等。 其次雞軟骨中的硫酸軟骨素作為結(jié)締組織天然存在的重要成分，與膠原蛋白一起發(fā)揮關(guān)節(jié)保護(hù)作用[4，5]。目前關(guān)于雞軟骨肽發(fā)揮關(guān)節(jié)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)借助LC-MS/MS以及物種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)雞軟骨肽化學(xué)組成及抗氧化、抗炎活性成分進(jìn)行研究，相關(guān)成果將為雞軟骨肽在保健食品及藥品中的應(yīng)用提供方法學(xué)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1材料 雞軟骨肽，以雞胸軟骨為原料，通過(guò)生物可控的酶解技術(shù)制備而得的多肽混合物，采用凱氏定氮法測(cè)得其蛋白含量為73.7%；合成多肽由合肥國(guó)肽生物科技有限公司合成并提供；ANT-300全自動(dòng)定氮儀(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)；ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Q Exactive質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；多標(biāo)記酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；IL-1β試劑盒、PGE2 試劑盒、TNF-α試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1氨基酸組成分析 采用異硫氰酸苯酯(PITC)-柱前衍生高效液相色譜法檢測(cè)雞軟骨肽水解后所得氨基酸的組成，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]，雞的氨基酸組成主要包括16種氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)，羥脯氨酸和羥賴氨酸分別是軟骨中膠原蛋白的重要成分之一，因此本實(shí)驗(yàn)以上述18種氨基酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。具體方法如下：分別稱取適量上述十八種氨基酸對(duì)照品，用0.1 mol/L的稀鹽酸溶解，配成濃度為50 μg/ml的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取適量十八種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合均勻，得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液。稱取0.1 g雞軟骨肽樣品，加入0.5%苯酚的50%的鹽酸4 ml，于安瓿瓶中熔封，150℃加熱1 h，過(guò)濾，揮干溶劑，再加入5 ml 0.1 mol/L的稀鹽酸溶解，得雞軟骨肽樣品溶液。

吸取200 μl十八種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(或樣品溶液)于1.5 ml EP管中，再加入100 μl三乙胺溶液和100 μl PITC溶液，混合均勻后，于40℃水浴條件下反應(yīng)1 h后，加入400 μl正己烷，渦旋振蕩后靜置30 min，取下相200 μl加800 μl水混勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。所有供試品溶液將采用以下條件進(jìn)行HPLC分析[氨基酸專用柱Sepax AAA4.6×250 mm，5 μm；流動(dòng)相A：0.1 mol/L醋酸銨(pH6.5)∶乙腈=93∶7；流動(dòng)相B ：80%乙腈水溶液；柱溫：36℃；流速：1.0 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣量：10 μl]。

1.2.2氨基酸測(cè)序 稱量雞軟骨肽樣品適量，加入離子水使其完全溶解，并使樣品溶液濃度為100 mg/ml。樣品溶液采用 C18 小柱進(jìn)行除鹽，具體操作如下：C18小柱依次加入 1 ml 100%乙腈溶液、1 ml 0.1%的 TFA 溶液，然后加入1 ml樣品溶液，控制流速，使溶液緩慢流出，重復(fù)一次；加入 800 μl 0.1%的 TFA，重復(fù)一次；加入 500 μl的洗脫液(50%CAN，0.1%TFA)，并收集流出溶液，重復(fù)一次，合并溶液。所得流出液即雞軟骨肽洗脫液，凍干，樣品保存在-20℃冰箱待用。

凍干樣品用800 μl 0.1%甲酸溶液溶解，9 000 r/min離心10 min，取上清15 μl于進(jìn)樣瓶中進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)分析。液相為ACQUITY UPLC (waters)，進(jìn)樣1 μl，色譜柱為C18，3 μm，250 mm×75 μm(Eksigent)。60 min色譜梯度，3.0 μl/min的色譜流速，1張MS譜中選10個(gè)強(qiáng)度最高的離子進(jìn)行MS/MS分析，質(zhì)譜分析在Q Exactive(thermo)上進(jìn)行。

獲得雞軟骨肽MS/MS離子碎片峰信息后，將所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)在NCBI物種 (Gallus gallus)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜庫(kù)檢索，搜庫(kù)條件：串聯(lián)質(zhì)譜檢索(MS/MS Ion Search)；Trypsin酶切；M氧化和碘乙酰胺烷基化為可變修飾；漏切位點(diǎn)為1；Peptide質(zhì)量誤差為±10 ppm；Fragment質(zhì)量誤差為±0.05 Da。搜庫(kù)檢索后，利用MASCOT軟件打分，選擇卡值 ion score>35的雞軟骨肽多肽片段(大于35分即成功鑒定，可靠性達(dá)到顯著水平)，即為雞軟骨肽代表肽段。

1.2.3雞軟骨肽代表肽段體外抗氧化能力評(píng)價(jià) 對(duì)雞軟骨肽代表肽段采取固相合成的方法進(jìn)行制備，使各多肽純度達(dá)到95%以上，凍干保存。

①DPPH法測(cè)定雞軟骨肽代表肽段抗氧化能力：以蒸餾水、5%的DMSO溶液為空白對(duì)照，分別取蒸餾水、5%DMSO、樣品溶液150 μl，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液150 μl，渦旋混勻后，于暗處反應(yīng)90 min，即得供試品溶液。用紫外分光光度計(jì)在517 nm測(cè)定其吸光度，并計(jì)算各樣品DPPH清除率。DPPH清除率(%)=1-Ax/A0×100%Ax表示樣品在517 nm處的吸光度，A0表示空白對(duì)照組在517 nm處的吸光度。②水楊酸法測(cè)定雞軟骨肽代表肽段清除羥基自由基的能力 以蒸餾水、5%的DMSO溶液為空白對(duì)照，分別取蒸餾水、5% DMSO、樣品溶液(4 mg/ml)50 μl，加入4 mmol/L FeSO4溶液50 μl，4 mmol/L 水楊酸無(wú)水乙醇溶液50 μl，混合搖勻，放置10 min后，再向其中加入4 mmol/L H2O2溶液50 μl，混合搖勻，在37℃條件下反應(yīng)20 min后，即得供試品溶液。用紫外分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定各溶液吸光度，并計(jì)算各樣品對(duì)羥基自由基的清除率。羥基自由基清除率(%)=1-Ax/A0×100%。Ax表示樣品在510 nm處的吸光度，A0表示空白對(duì)照組在510 nm處的吸光度。③FRAP方法測(cè)定雞軟骨肽代表肽段總抗氧化能力 取FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣品溶液(4 mg/ml)100 μl，分別加入1 ml新鮮配制的TPTZ工作液，混合搖勻，在37℃反應(yīng)10 min后，紫外分光光度計(jì)于593 nm測(cè)定其吸光度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程，樣品溶液吸光度代入方程并計(jì)算結(jié)果。

樣品總抗氧化能力以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液表示，F(xiàn)RAP表示為每1克樣品相當(dāng)于FeSO4的摩爾數(shù)(nmol/g)。

1.2.4雞軟骨肽代表肽段對(duì)H2O2致C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用評(píng)價(jià) 將C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用1 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化40 s后，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再將C518 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按3×104個(gè)/ml接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置空白組、模型組(1.0 mmol/L H2O2)、候選代表肽組(1.0 mmol/L H2O2+1.0 mg/ml各候選代表肽)，培養(yǎng)24 h后加入CCK-8試劑10 μl，反應(yīng)3 h后于450 nm測(cè)定各孔OD值。

1.2.5雞軟骨肽代表肽段對(duì)LPS誘導(dǎo)的C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥模型的抗炎作用評(píng)價(jià) 采用體外脂多糖(LPS)刺激C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞建立炎癥模型，并給予雞軟骨肽代表肽段進(jìn)行干預(yù)，觀察C518細(xì)胞分泌的相關(guān)炎癥因子的變化，以此對(duì)雞軟骨肽代表肽段抗炎活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

將C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用1 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化40 s后，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再將C518 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按1×105個(gè)/ml接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置空白組、模型組(10 μg/ml LPS)、雞軟骨肽代表肽段組(10 μg/ml LPS+1.0 mg/ml各雞軟骨肽代表肽段)，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基上清液(-20℃保存?zhèn)溆?，分別測(cè)定上清液中IL-1β、PGE2、TNF-α 3種炎癥因子的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1氨基酸組成分析結(jié)果 通過(guò)對(duì)18種氨基酸混合液、水解雞軟骨肽樣品的柱前衍生HPLC檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行峰面積占比計(jì)算，獲得18種氨基酸在雞軟骨肽中的占比情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。其中占比最高的是甘氨酸(G)29.5%，其次為脯氨酸(P)11.63%、丙氨酸(A)10.61%、谷氨酸(E)9.2%。

圖1 雞軟骨肽氨基酸組成

表1 雞軟骨肽代表肽段氨基酸序列及分子量

Tab.1 Amino acid sequence and molecular weight of chicken cartilage peptides

No.AbbreviationSequenceMW(Da)1G1VAIQAVLSLYASGR1 446.822G2SYELPDGQVITIGNER1 789.893G3ESYVETELIFALAK1 611.844G4MEGNAEESTLFCFAVRG1 859.825G5IAEEFEVELER1 362.676G6GPRGPPGPVGP986.537G7FFWEMAEEEGWIR1 728.768G8GRPGPPGPVGP986.539G9MPSPLPRS883.4610G10ELSDSSDGLEVK1 277.6011G11GPAGPSGPR794.40

2.2氨基酸測(cè)序結(jié)果 對(duì)雞軟骨肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行NCBI物種蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)檢索后，共得到3 077條肽段，選擇MASCOT軟件打分，在卡值 ion score>35的條件下，共確定11個(gè)雞軟骨肽代表肽段，氨基酸序列和分子量信息見(jiàn)表1。

2.3雞軟骨肽代表肽段體外抗氧化能力評(píng)價(jià)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖2、3。在DPPH清除率方面，G4、G3、G2、G1活性最強(qiáng)；在OH·清除率方面，G4、G5、G10、G7活性最強(qiáng)；在FRAP總抗氧化能力方面，G3、G1、G2活性最強(qiáng)。對(duì)11條多肽分別按照DPPH清除率、OH·清除率、FRAP檢測(cè)數(shù)據(jù)大小進(jìn)行排序，獲得綜合抗氧化能力強(qiáng)弱排序?yàn)镚4、G3、G2、G1、G10、G5、G11、G7、G6、G9、G8。

2.4雞軟骨肽代表肽段對(duì)H2O2致C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用評(píng)價(jià)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖4。經(jīng)濃度為1 mmol/L的H2O2溶液處理后，模型組細(xì)胞損傷率達(dá)到69.7%，與空白組相比，有極顯著性差異，表明此次造模成功。各代表肽組與模型組相比，均存在極顯著差異，說(shuō)明候選的11條代表肽都能不同程度抵抗H2O2對(duì)C518細(xì)胞造成的氧化性損傷，且效果明顯。在候選代表肽中，對(duì)C518細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用較強(qiáng)的肽段依次為G10、G1、G4、G9、G11等代表肽段。

圖2 雞軟骨肽代表肽段的抗氧化能力(DPPH清除率、OH·清除率)

圖3 雞軟骨肽代表肽段抗氧化能力評(píng)價(jià)(FRAP value)

2.5雞軟骨肽代表肽段對(duì)LPS誘導(dǎo)的C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥模型的抗炎作用評(píng)價(jià)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖5。在11條雞軟骨肽代表肽段中，只有G4能夠顯著降低IL-1β水平(P<0.05)，其余無(wú)顯著性差異；G1、G2、G9能夠顯著降低PGE2水平(P<0.05)，其余無(wú)顯著性差異；G4、 G1、G3、G5、G6、G7、G9、G10、G11能夠顯著降低TNF-α水平(P<0.05)，其中G4組效果最為明顯(P<0.01)。綜合來(lái)看，G4抗炎效果最優(yōu)，其次為G1、G9、G7。

圖4 雞軟骨肽代表肽段對(duì)H2O2致C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞氧化損傷的影響(以O(shè)D值計(jì))

圖5 雞軟骨肽代表肽段對(duì)LPS誘導(dǎo)的C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥模型的抗炎作用

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞軟骨肽的氨基酸組成以甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、谷氨酸(Q)為主，占比超過(guò)60%，與吳雷等[8]報(bào)道的檢測(cè)結(jié)果基本一致[9，10]。但由于本實(shí)驗(yàn)所用原料為雞軟骨酶解混合多肽，并未進(jìn)行膠原蛋白的純化，其羥脯氨酸占比偏低。將雞軟骨肽氨基酸組成與鑒定出的11條雞軟骨肽肽段進(jìn)行對(duì)比可知，G2(SYELPDGQVITI-GNER)、G4(MEGNAEESTLFCFAVRG)、G6(GPRGPPGPVGP)、G8(GRPGPPGPVGP)、G11(GPAGPS-GPR)等五個(gè)肽段的氨基酸組成與雞軟骨肽的整體氨基酸組成相似度相對(duì)較高。

進(jìn)一步對(duì)雞軟骨肽代表肽段抗氧化、抗炎作用分析發(fā)現(xiàn)，DPPH清除率、OH·清除率、FRAP三個(gè)指標(biāo)的抗氧化綜合能力強(qiáng)弱排序?yàn)镚3、G2、G4、G1、G10、G5、G11、G7、G6、G9、G8，對(duì)H2O2致C518細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用較強(qiáng)的肽段依次為G10、G1、G4、G9、G11，對(duì)LPS誘導(dǎo)的C518大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的抗炎作用較強(qiáng)的肽段依次為G4、G1、G9、G7。綜合抗氧化、抗炎作用評(píng)價(jià)結(jié)果，可知G4綜合功效最佳，其次為G1。而G4的氨基酸組成與雞軟骨肽的整體氨基酸組成相似度相對(duì)較高，推測(cè)G4(MEGNAEESTLFCFAVRG)可能是雞軟骨肽的主要活性片段之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在確定雞軟骨肽氨基酸組成的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步借助LC-MS/MS以及物種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出11個(gè)氨基酸序列清晰、分子量明確的雞軟骨肽代表肽段，并確定了多條抗氧化、抗炎活性顯著的雞軟骨肽代表肽段。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)于雞軟骨肽化學(xué)結(jié)構(gòu)特征及功效的初步探索研究，相關(guān)研究成果將為雞軟骨肽在保健食品及藥品中的應(yīng)用提供方法學(xué)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。未來(lái)還可通過(guò)對(duì)雞軟骨肽進(jìn)行純化，并結(jié)合蛋白質(zhì)測(cè)序等更精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，深入開(kāi)展化學(xué)結(jié)構(gòu)特征研究。