石維娜 郝 杰 石新濤 (河北省中醫(yī)院脾胃病三科,石家莊 050011)

胃癌是我國(guó)最為常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)[1]，其致死率高[2]，目前胃癌的治療以手術(shù)切除為主要手段，但因早期胃癌無明顯癥狀，患者忍受性高，我國(guó)胃鏡普查推廣率低等導(dǎo)致很多胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期轉(zhuǎn)移階段，手術(shù)切除率低，化療也是胃癌的重要治療手段，但因化療副作用較大，導(dǎo)致效果不佳，5年生存率較低[3]。對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性胃癌患者而言，由于失去了最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)，一般常規(guī)給予化療治療，但隨著治療周期的增加，患者也逐漸出現(xiàn)耐藥的情況[4]，不良反應(yīng)增加，如骨髓抑制等[5],化療藥物也可以對(duì)患者的機(jī)體免疫功能造成損害，使得患者的治療依從性和治療效果因此受到限制[6]。故而，尋找新的有效且安全的藥物成為治療晚期胃癌的一大挑戰(zhàn)。

而我國(guó)作為中醫(yī)的起源地，有著龐大的中藥儲(chǔ)存及史料記載，其中很多中藥就被報(bào)道有抗腫瘤的特性，其中，三七便是一種。三七的主要成分是三七總皂苷，其抗腫瘤作用在多種類型的腫瘤中已被報(bào)道。如鄭文球等[7]報(bào)道了三七皂苷R1可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系HL-60發(fā)生凋亡而起到抗腫瘤作用；柴瑞華等[8]報(bào)道了三七總皂苷對(duì)S180腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用和延長(zhǎng)艾氏腹水癌小鼠生存期的影響；吳映雅等[9]則提出三七總皂苷對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。但對(duì)于三七在胃癌中的作用研究卻鮮有報(bào)道，基于此，本研究旨在探索三七總皂苷是否可以抑制胃癌細(xì)胞系的體外生物學(xué)行為及其可能涉及的機(jī)制，為臨床上治療胃癌提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞培養(yǎng)基1640購(gòu)自美國(guó)Coring公司(批號(hào)10-040-CVR)；氨芐青霉素、鏈霉素購(gòu)自北京聚合美生物技術(shù)公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)康寧公司(貨號(hào)BD,356234)；胎牛血清購(gòu)自 Gibco 公司(貨號(hào)10099-141)；細(xì)胞用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、各種型號(hào)的槍頭、移液槍、Transwell小室、共聚焦小皿等常用耗材均購(gòu)自北京普京康利有限公司；甲醇、多聚甲醛電泳液、電轉(zhuǎn)液、TBST等化學(xué)試劑均購(gòu)自北京通廣試劑公司；相關(guān)指標(biāo)抗體Vemintin(貨號(hào)D21H3)、SNAIL(貨號(hào)C15D3)、MMP2(貨號(hào)D4M2N)、MMP9(貨號(hào)D6O3H)、P21(貨號(hào)12D1)、Caspase-3(貨號(hào)D3R6Y)、BAX(貨號(hào)D2E11)和β-catenin(貨號(hào)D10A8)均購(gòu)自美國(guó)CST公司；凋亡試劑盒、ECLPls化學(xué)發(fā)光試劑盒、HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗及HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；PVDF(IPVH00010)轉(zhuǎn)印膜購(gòu)自密理博(Millipore)公司，iFluor 594羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗購(gòu)自PTG生物有限公司；核漿蛋白分離提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、Triton×100購(gòu)自普利萊有限公司；電泳槽、配膠架及電轉(zhuǎn)槽等Western blot耗材均購(gòu)自北京天能有限公司；三七總皂苷粉末購(gòu)自西安飛達(dá)有限公司；FzM1.8購(gòu)自MCE公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)用的人胃癌細(xì)胞系：SGC-790、BGC-823及MKN-4均購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫，培養(yǎng)體系為含 10%FBS (Gibco,USA)+1% 雙抗RPMI-1640(Coring,USA)，在5%CO2的37℃孵箱環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用經(jīng)典的CCK8方法檢測(cè)三七總皂苷對(duì)人胃癌細(xì)胞系增殖能力的影響。首先將人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4按照倍比稀釋的方法在96孔板中以3 000個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板后，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)6 h，待細(xì)胞貼壁完全后，棄去舊培養(yǎng)基，更換含200 mg/L[10]的三七總皂苷新鮮培養(yǎng)基，并于換液后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h對(duì)孔內(nèi)細(xì)胞的OD值進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量時(shí)依據(jù)CCK8試劑盒說明書，每孔更換無血清培養(yǎng)基100 μl 后添加10 μl CCK8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后于酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，記錄數(shù)值并計(jì)算。

1.2.3細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn) 將合適密度的人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使其密度至70%～80%，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用100 μl的槍頭在培養(yǎng)板中劃線，縱穿整個(gè)培養(yǎng)板，隨后用PBS將滑落的細(xì)胞洗去，后用含200 mg/L的三七總皂苷無血清新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS洗去懸浮的細(xì)胞后，用多聚甲醛固定15 min，并于倒置顯微鏡下觀察拍照，以供后續(xù)分析。

1.2.4細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 做實(shí)驗(yàn)之前提前將基質(zhì)膠置于4℃冰箱中過夜解凍化開，并用無血清培養(yǎng)基按照1∶8的比例進(jìn)行稀釋，隨后將稀釋的基質(zhì)膠取150 μl均勻鋪于小室上室中，使其覆蓋上室，隨后將小室放入培養(yǎng)箱內(nèi)約4 h使其凝固。同時(shí)，將人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4消化下來并用含200 mg/L的三七總皂苷無血清新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為3×105個(gè)/ml，取100 μl接種于Transwell上室，下室加入10%FBS的培養(yǎng)基500 μl，注意此過程中避免產(chǎn)生氣泡，然后將小室放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后取出小室，用PBS輕柔清洗上室2～3次，用棉棒在上室內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，以達(dá)到除去上室內(nèi)未穿膜細(xì)胞的目的，隨后將穿膜的細(xì)胞用95%的乙醇室溫固定10～15 min，并用0.3%的結(jié)晶紫溶液進(jìn)行細(xì)胞染色15 min，PBS清洗2～3次后，風(fēng)干后置于倒置顯微鏡下拍照采圖，隨機(jī)選取5個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后取平均值。

1.2.5免疫印跡試驗(yàn) Vemintin、SNAIL、MMP2、MMP9、P21、Caspase-3、BAX和β-catenin等蛋白的表達(dá)水平采用Western blot進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞在含三七總皂苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h或者用三七總皂苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h并加入FzM1.8(2 μm，15 min)[11]后，用RIPA buffer(含蛋白酶抑制劑)裂解液收集細(xì)胞的蛋白樣品，其中檢測(cè)β-catenin的樣品組按照核漿蛋白分離提取試劑盒的產(chǎn)品說明書進(jìn)行提取，并進(jìn)一步用牛血清蛋白(BCA)試劑盒對(duì)所提取的蛋白質(zhì)樣品的濃度進(jìn)行測(cè)定。其余的蛋白樣品用Loading buffer煮沸后保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，各組分別取30 μg蛋白總量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，隨后經(jīng)電轉(zhuǎn)操作將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，進(jìn)一步進(jìn)行常溫封閉2 h，一抗4℃過夜孵育，二抗常溫孵育2 h后，根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書對(duì)PVDF膜上的蛋白印跡進(jìn)行曝光顯色，并保存圖片，用Image J 進(jìn)行灰度分析。

1.2.6細(xì)胞免疫熒光 提前將人胃癌細(xì)胞系SGC-790鋪于共聚焦小皿中，使其細(xì)胞密度約為70%～80%，置于培養(yǎng)箱中6 h待其貼壁完全之后，將培養(yǎng)基換成含三七總皂苷的培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，用多聚甲醛將細(xì)胞進(jìn)行固定15 min，PBS浸洗小皿3次，每次5 min，隨后用0.5%Triton室溫孵育15 min 進(jìn)行通透，PBS浸洗3次，每次5 min，用山羊血清室溫封閉2 h，PBS浸洗3次，每次5 min，一抗β-catenin(1∶100)過夜孵育，二抗常溫孵育2 h，DAPI常溫孵育15 min后PBS清洗3次，每次 5 min，并置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1三七總皂苷可以抑制人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的增殖能力 由圖1可見，人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的增殖能力在三七總皂苷處理之后顯著降低(P<0.05)。

2.2三七總皂苷可以抑制人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的遷移能力 由圖2可見，人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的遷移能力在三七總皂苷處理之后顯著降低(P<0.05)。

2.3三七總皂苷可以抑制人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的侵襲能力 由圖3可見，人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的侵襲能力在三七總皂苷處理之后顯著降低(P<0.05)。

2.4三七總皂苷可以誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的凋亡 由圖4可見，人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4的凋亡水平在三七總皂苷處理之后顯著增加(P<0.05)。

圖1 人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經(jīng)三七總皂苷處理之后的增殖能力變化

圖2 人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經(jīng)三七總皂苷處理之后的遷移能力變化

圖3 人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經(jīng)三七總皂苷處理之后的侵襲能力變化

圖4 人胃癌細(xì)胞系SGC-790、BGC-823及MKN-4經(jīng)三七總皂苷處理之后的凋亡水平變化

2.5三七總皂苷可以下調(diào)人胃癌細(xì)胞系SGC-790中轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，并上調(diào)周期阻滯蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 由圖5可見，人胃癌細(xì)胞系SGC-790經(jīng)三七總皂苷處理之后MMP2、MMP9、Vemintin、SNAIL蛋白水平顯著減少，P21、BAX、Caspase-3蛋白水平顯著增加(P<0.05)。

圖5 人胃癌細(xì)胞系SGC-790經(jīng)三七總皂苷處理之后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化

圖6 三七總皂苷抑制SGC-790細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路活性

2.6三七總皂苷可以抑制人胃癌細(xì)胞系SGC-790中WNT/β-catenin通路活性 由圖6可見，人胃癌細(xì)胞系SGC-790經(jīng)三七總皂苷處理之后，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白水平減少，其細(xì)胞空間定位發(fā)生改變，β-catenin核內(nèi)定位減少(P<0.05)。

3 討論

三七總皂苷是五加科植物三七根莖中提取的主要有效成分，其藥用廣泛，具有諸多作用，如活血化瘀[12]，減緩氧化[13]，提高機(jī)體免疫功能[14]等。三七總皂苷可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用也屢見報(bào)道。尚西亮等[15]觀察到三七總皂苷可以通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡而起到抑制肝癌進(jìn)展的作用，程馥艷等[16]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以通過增加IL-18及TNF-α而對(duì)HepG2移植瘤起到抑制作用；孫晶[17]報(bào)道了三七總皂苷可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯而起到抑制增殖的作用；阮越勇等[18]報(bào)道了三七總皂苷通過對(duì)肺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用而起到抑癌作用[18]?？梢姡呖傇碥湛梢酝ㄟ^多種機(jī)制參與腫瘤的進(jìn)程調(diào)控，而作為一種性溫的中藥成分，三七總皂苷與化療藥物或放療的聯(lián)用也逐漸受到臨床醫(yī)生的重視，可以增加療效，減少副作用，如吳珊珊等[19]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷能顯著協(xié)同增加三苯氧胺抗乳腺癌的作用,其機(jī)制可能與調(diào)控mTOR信號(hào)通路,逆轉(zhuǎn)三苯氧胺耐藥有關(guān)；張瑋等[20]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷聯(lián)合X線可顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移能力,增加肝癌細(xì)胞的凋亡;張瑋等[21]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷聯(lián)合順鉑可顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的增殖,且能顯著降低肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力,增加肝癌細(xì)胞的凋亡。這些證據(jù)都提示，三七總皂苷具有巨大的臨床應(yīng)用潛力，可以從多個(gè)方面起到抑癌作用。

胃癌具有高度侵襲性，其發(fā)病率及死亡率高，目前其發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制仍處于艱難的探索階段[22]。而WNT通路除了與胚胎發(fā)育調(diào)控有著密切關(guān)系之外，其與腫瘤的進(jìn)程也存在顯著的相關(guān)性[23]，參與多種腫瘤的調(diào)控。WNT通路在胃癌中存在異常激活狀態(tài)，其可以對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲等腫瘤學(xué)行為發(fā)揮調(diào)控作用。Huang等[24]提出WNT通路的激活可以使得胃癌細(xì)胞系發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移侵襲等進(jìn)程；Weng等[25]提出WNT通路失活后，胃癌細(xì)胞系的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力也隨之下降，而黏附能力增加，胃癌進(jìn)程得以抑制；張華等[26]、肖登峰等[27]提出WNT/β-catenin通路與胃癌分化及轉(zhuǎn)移之間存在著顯著的臨床相關(guān)性。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可以抑制胃癌細(xì)胞系體外的生物學(xué)行為，包括增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等，不僅在細(xì)胞表型功能上起到明顯的抑制作用，而且在蛋白水平上也得到了相應(yīng)的驗(yàn)證，如MMP2、MMP9、Vemintin、SNAIL等蛋白水平的減少可以提示，三七總皂苷確實(shí)抑制胃癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，且三七總皂苷可以增加P21的表達(dá)，意味著其可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系發(fā)生G1/S周期阻滯，這與增殖能力受阻的表型相一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡，不僅細(xì)胞凋亡比例增高，其凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及BAX表達(dá)水平也有顯著提高。在機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可以使β-catenin的細(xì)胞核內(nèi)分布減少，細(xì)胞核內(nèi)蛋白水平減少，且Wnt激活劑可以逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)，這提示，三七總皂苷可以通過抑制WNT/β-catenin通路起到抑制胃癌細(xì)胞系增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡，這為臨床上應(yīng)用三七總皂苷治療胃癌提供了理論基礎(chǔ)。