代云龍 吳禮國 章志軍 歐 揚 黃俊偉 彭 兵 (溫江區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科，溫江 611130)

胰腺癌是消化道類腫瘤中惡性程度極高的一種，其解剖位置的特殊性導(dǎo)致大部分胰腺癌患者確診時已為晚期，手術(shù)切除率低，對抗癌藥物的敏感性也低，因此其預(yù)后極差，病死率在所有腫瘤中居第4位[1,2]。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，異常高表達會誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，目前研究表明，在胰腺癌腫瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路激活后，能夠促進其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移并抑制細胞凋亡[3,4]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通常以同源或異源二聚體形式存在于細胞的胞質(zhì)中，p65作為其活性部分，可通過調(diào)控細胞凋亡等基因表達水平來參與到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程中[5]。淫羊藿苷是從傳統(tǒng)中藥淫羊藿中分離出來的黃酮類化合物，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括抗炎，抗抑郁，改善男性性功能，保護心血管，增強骨愈合和神經(jīng)保護作用[6]，此外，淫羊藿苷已被證明在各種人類癌細胞中發(fā)揮體外抗增殖作用，例如結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等[7-9]，但淫羊藿苷體內(nèi)抗癌活性的相關(guān)研究較少。本研究旨在通過建立裸鼠移植瘤模型，并給予不同劑量淫羊藿苷及阿霉素腹腔注射，檢測瘤體中癌細胞生長、運動及Wnt/β-catenin、NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白的表達情況，為胰腺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物來源 清潔級雌性BALB/c小鼠125只，4～5周齡，平均體重(16.37±1.07)g，購自北京阜康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0009]，所有BALB/c裸鼠均飼養(yǎng)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2015-0035]。

1.1.2主要試劑及儀器 人胰腺癌SW1990細胞株(上海細胞研究所，本實驗室自行傳代培養(yǎng))；淫羊藿苷(中國藥品生物制品檢定所，純度99.9%)；阿霉素(美國Sigma公司)；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；Ki67、VEGF、Caspase-3、MMP-9引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；全蛋白提取、BCA蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)；兔抗小鼠Ki67、VEGF、β-catenin、p65、p-p65、GAPDH多克隆抗體(美國Abcam公司)；TDL-4臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；IX51倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Image Master VDS凝膠自動成像儀(瑞典Pharmacia公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人胰腺癌SW1990細胞株在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素或鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，用生理鹽水進行漂洗后，0.25%胰蛋白酶消化液處理2 min后棄除胰蛋白酶，再加入完全培養(yǎng)基洗脫細胞，制成細胞懸液。

1.2.2移植瘤模型制備及處理 將1.2.1中制備好的細胞懸液濃度調(diào)整為1×108ml-1后注射于裸鼠右腋下，腫瘤直徑大于5 mm時則成為移植瘤標(biāo)準，將制備成功的裸鼠隨機等分為對照組、低、中、高劑量淫羊藿苷組、阿霉素組，每組25只，其中對照組在腫瘤周圍皮下注射鹽水，低、中、高劑量淫羊藿苷組于腹腔注射10、20、40 mg/kg的淫羊藿苷溶液，1周連續(xù)注射5次，連續(xù)3周，阿霉素組于腹腔注射5 mg/kg 的阿霉素溶液，每周第1天和第4天注射，連續(xù)3周，注射后繼續(xù)培養(yǎng)3 d后處死裸鼠，分離腫瘤并測定腫瘤質(zhì)量及體積，并將一部分腫瘤組織置于4%甲醛溶液中固定，用于癌細胞凋亡觀察以及免疫組化觀察，另一部分腫瘤組織置于-80℃存儲，用于qRT-PCR與Western blot檢測。各組裸鼠試驗期間均在培育室飼養(yǎng)，溫度20～25℃，濕度保持在50%～55%，進行人工光照(12 h/晝、12 h/夜)，裸鼠全天自由飲水與飲食。

1.2.3腫瘤大小、體積及小鼠存活率檢測 將1.2.2中分離得到的腫瘤組織用游標(biāo)卡尺測量其長徑(a)和短徑(b)，并根據(jù)公式：腫瘤體積(V)=a×b2/2計算腫瘤體積；記錄各組小鼠存活情況。

1.2.4TUNEL染色觀測瘤組織癌細胞凋亡情況 取1.2.2中各組裸鼠移植瘤組織進行常規(guī)石蠟包埋，根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒中說明書進行操作，并在顯微鏡下觀察并采集圖像。隨機選取5個視野，記錄200個細胞中陽性細胞數(shù)，細胞凋亡情況運用末端標(biāo)記技術(shù)TUNEL法檢測且采用TUNEL指數(shù)表示。細胞核呈現(xiàn)為棕黃色者視為凋亡細胞。

1.2.5免疫組化觀察瘤組織中Ki67、VEGF蛋白陽性表達率 取1.2.2中各組裸鼠移植瘤組織進行常規(guī)石蠟包埋切片后，脫水、PBS溶液漂洗、3% H2O2與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原修復(fù)、PBS漂洗5 min、加入一抗37℃反應(yīng)2 h、PBS漂洗5 min、加入二抗37℃反應(yīng)40 min、PBS漂洗5 min、DAB室溫顯色20～30 min，鏡檢觀察有棕黃色顆粒出現(xiàn)時則采用自來水終止。再用蘇木素復(fù)染30 s、自來水漂洗、中性樹膠封片，光鏡下觀察細胞樣本中Ki67、VEGF的陽性表達細胞，其細胞漿表現(xiàn)為棕黃色顆粒。每張片子400×視野10個，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)目，以計算陽性細胞率，陽性細胞率(%)=陽性細胞數(shù)目/總細胞計數(shù)×100%。

1.2.6qRT-PCR檢測瘤組織中Ki67、VEGF、Caspase-3、MMP-9相對表達水平 按照總RNA提取試劑盒說明書上操作步驟提取各組小鼠瘤組織中的總RNA，提取后用紫外分光光度計檢驗，OD值(A260/A280)=1.8～2.0，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系(10 μl)：2×miRNA反應(yīng)混合液5 μl，0.1 % BSA 1 μl，miRNA PrimeScript-RT酶混合物 1 μl，總RNA 0.5 μl，去RNA酶ddH2O 2.5 μl。反應(yīng)條件設(shè)置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。PCR體系10 μl：SYBR-Prmix Ex Tap II(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl。詳細操作見試劑盒說明書。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：50℃激活聚合酶5 min，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進行40個循環(huán)。溶解曲線繪制：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。每個樣孔設(shè)置3個復(fù)孔。用2-ΔΔCt法計算mRNA的表達量。

1.2.7Western blot檢測瘤組織中β-catenin、p65、p-p65表達水平 將1.2.2中提取的瘤組織用BCA法提取總蛋白后，利用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗鼠β-catenin、p65、p-p65、GAPDH(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1淫羊藿苷對小鼠移植瘤重量、體積及存活率的影響 與對照組相比，中、高劑量淫羊藿苷及阿霉素干預(yù)后，瘤體重量及體積均顯著降低見圖1、表1，25 d 存活率顯著升高見圖2、表1，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2淫羊藿苷對瘤體癌細胞凋亡的影響 TUNEL結(jié)果顯示：與對照組相比，中、高劑量淫羊藿苷及阿霉素處理后癌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖3、表2。

2.3淫羊藿苷對瘤組織中Ki67、VEGF蛋白陽性表達率的影響 免疫組化結(jié)果顯示：與對照組相比，中、高劑量淫羊藿苷及阿霉素處理后癌組織中Ki67、VEGF蛋白的陽性表達率顯著降低(P<0.05)。見圖4、表3。

2.4淫羊藿苷對瘤組織中Ki67、VEGF、Caspase-3、MMP-9相對表達水平的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示：與對照組相比，中、高劑量淫羊藿苷及阿霉素處理后癌組織中Ki67、VEGF、MMP-9相對表達水平顯著降低(P<0.05)，Caspase-3相對表達水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

圖1 各組裸鼠瘤體情況比較

GroupsWeight(g)Volume(mm3)Survival rate(%)Control group0.49±0.051864.03±294.3252.0010 mg/kg icariin group0.45±0.061798.18±209.1844.0020 mg/kg icariin group0.26±0.031)932.63±164.521)80.001)40 mg/kg icariin group0.15±0.041)423.59±127.411)92.001)Adriamycin group0.14±0.031)349.78±96.791)96.001)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖2 各組裸鼠25 d存活率比較

GroupsApoptotic rate(%)Control group5.12±1.5310 mg/kg icariin group5.24±1.2720 mg/kg icariin group28.35±4.811)40 mg/kg icariin group46.57±6.211)Adriamycin group48.25±7.421)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖4 各組裸鼠瘤組織的免疫組化結(jié)果(×400)

GroupsKi67 positiveexpression rate(%)VEGF positiveexpression rate(%)Control group30.48±8.5361.25±18.5310 mg/kg icariin group25.24±1.2758.21±16.2720 mg/kg icariin group8.55±2.621)37.65±12.511)40 mg/kg icariin group3.52±1.171)22.34±10.171)Adriamycin group2.12±0.481)20.08±8.251)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

GroupsKi67 mRNA(2-ΔΔCt)VEGF mRNA(2-ΔΔCt)Caspase-3 mRNA(2-ΔΔCt)MMP-9 mRNA(2-ΔΔCt)Control group1.00±0.021.00±0.031.00±0.011.00±0.0110 mg/kg icariin group0.93±0.070.82±0.081)1.06±0.080.85±0.0920 mg/kg icariin group0.61±0.031)0.44±0.061)1.92±0.351)0.47±0.071)40 mg/kg icariin group0.25±0.041)0.13±0.021)4.25±0.941)0.15±0.041)Adriamycin group0.31±0.051)0.11±0.021)4.01±0.891)0.16±0.031)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖5 各組裸鼠瘤組織中β-catenin、p65、p-p65蛋白表達圖譜

GroupsProtein expression(IATarget protein:IAGAPDH)β-cateninp-p65/p65Control group0.25±0.040.52±0.0510 mg/kg icariin group0.16±0.051)0.45±0.061)20 mg/kg icariin group0.06±0.021)0.19±0.031)40 mg/kg icariin group0.03±0.011)0.06±0.021)Adriamycin group0.01±0.011)0.03±0.011)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

2.5淫羊藿苷對瘤組織中β-catenin、p65、p-p65表達水平的影響 Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，不同劑量淫羊藿苷及阿霉素處理后癌組織中β-catenin蛋白表達水平及p65蛋白磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)。見圖5、表5。

3 討論

淫羊藿又稱為“仙靈脾”，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效，目前從淫羊藿中分離出的單體化合物的種類已超過260種，大部分為黃酮類化合物，其中淫羊藿苷含量最高[10]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，淫羊藿苷具有促神經(jīng)突觸生長、抗神經(jīng)元損傷、促進骨代謝、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等多種活性[11]。體外抗腫瘤活性實驗發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達，促進凋亡相關(guān)蛋白表達來降低人食管癌細胞增殖黏附能力[12]；在卵巢癌中可以通過下調(diào)促癌基因RNA-21表達，促進抗癌基因PTEN、RECK蛋白表達抑制細胞增殖，加速細胞死亡[13]。本次研究通過注射人胰腺癌SW1990細胞株建立裸鼠移植瘤模型，并通過腹腔注射不同劑量淫羊藿苷來觀察其體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，20 mg/kg和40 mg/kg劑量的淫羊藿苷處理后，移植瘤的重量及體積顯著降低，且小鼠存活率顯著升高，但10 mg/kg劑量的淫羊藿苷處理后，瘤體質(zhì)量、體積及存活率與對照組相比沒有明顯差異，表明在體內(nèi)淫羊藿苷同樣具有抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性具有濃度依賴性。同時本研究還利用TUNEL染色觀察了瘤組織中癌細胞凋亡情況，結(jié)果顯示20 mg/kg和40 mg/kg劑量的淫羊藿苷處理后，瘤組織中癌細胞凋亡率顯著升高，表明淫羊藿苷可能是通過促進癌細胞凋亡來抑制腫瘤生長的，Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤小鼠模型中，淫羊藿苷主要通過調(diào)控細胞周期蛋白及凋亡相關(guān)蛋白來發(fā)揮抗腫瘤作用，與本研究結(jié)果相似。

Ki67作為一種存在于增殖細胞核中的非組蛋白性核蛋白，與細胞周期高度相關(guān)，并且其在胰腺癌組織中的表達程度顯著高于正常胰腺組織[15]；VEGF則能夠增加血管的通透性，有利于腫瘤細胞浸入血管進而向淋巴及遠處細胞侵襲轉(zhuǎn)移[16]，并且VEGF還可以誘導(dǎo)MMP的產(chǎn)生，而MMP又能夠促進癌細胞對周圍組織的浸潤[17]。本研究利用免疫組化檢測了瘤組織中Ki67和VEGF蛋白的陽性表達率，結(jié)果顯示20 mg/kg和40 mg/kg劑量的淫羊藿苷處理后，瘤組織中Ki67和VEGF蛋白的陽性表達率均顯著降低，表明淫羊藿苷抗腫瘤活性除了通過促進細胞凋亡實現(xiàn)外，還與抑制細胞增殖及其侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。利用qRT-PCR對瘤組織中細胞生長和運動基因進行分析發(fā)現(xiàn)，凋亡執(zhí)行蛋白基因Caspase-3[18]相對表達量顯著升高，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵蛋白基因MMP-9的相對表達量降低，進一步證實了淫羊藿苷能夠抑制腫瘤細胞生長及運動[19]。

Wnt/β-catenin作為生物體內(nèi)的一條高度保守的信號通路，在胚胎發(fā)育及維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生理活動中發(fā)揮著重要的作用。經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路，主要通過β-catenin來傳遞信號，從而啟動下游靶基因表達，β-catenin在腫瘤發(fā)展進程中發(fā)揮著兩重功效，既可以通過與細胞膜上的E-cadherin結(jié)合，調(diào)控腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，又可以作為Wnt/β-catenin的重要信號傳遞子，其濃度決定著Wnt/β-catenin通路是激活還是抑制[20，21]。NF-κB信號通路主要負責(zé)連接氧化應(yīng)激和細胞凋亡過程，當(dāng)機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的時候，NF-κB會被激活進入細胞核中，通過與細胞凋亡基因c-myc等下游作用元件結(jié)合，促進細胞凋亡相關(guān)基因表達從而誘導(dǎo)細胞凋亡[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量淫羊藿苷處理后β-catenin蛋白表達以及NF-κB p65蛋白的磷酸化水平均顯著降低，表明淫羊藿苷可能通過抑制Wnt/β-catenin和NF-κB信號通路活性，來調(diào)控腫瘤生長運動。

綜上所述，淫羊藿苷可能通過抑制β-catenin和NF-κB p65的活性下調(diào)增殖及運動相關(guān)基因表達，上調(diào)凋亡相關(guān)基因表達從而調(diào)節(jié)小鼠胰腺癌皮下移植瘤的生長和運動。淫羊藿苷作為天然抗腫瘤藥物，具有很好的臨床使用價值，但胰腺癌的發(fā)生發(fā)展還受其他信號通路調(diào)控，還需要繼續(xù)深入研究。