孫 娟 葛雨竹 李姿慧 顏貴明 馬克龍 邵 菁 汪天明 汪長(zhǎng)中

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230012)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC) 是發(fā)生在結(jié)腸黏膜以及黏膜下層的一種慢性炎癥性腸病，臨床上以體重減輕、腹痛、腹瀉和黏液膿血便為主要癥狀或體征，少數(shù)患者在UC基礎(chǔ)上還可能進(jìn)一步發(fā)生惡性變。UC病因復(fù)雜，一般認(rèn)為與感染、環(huán)境暴露、遺傳等多因素相關(guān)，但無(wú)論何種病因，發(fā)病機(jī)制均涉及免疫調(diào)節(jié)失常[1]。近年來(lái)，腸道菌群紊亂在UC致病過(guò)程中的作用受到高度關(guān)注[2]。腸道具有豐富的微生態(tài)，細(xì)菌表面相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)與腸組織免疫細(xì)胞的TLRs等模式識(shí)別受體(PRR)相互作用，通過(guò)一定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活炎癥因子表達(dá)，導(dǎo)致腸組織免疫炎癥性損傷。TLR4是TLRs家族中的重要成員，通過(guò)識(shí)別相應(yīng)的PAMP，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，引發(fā)下游TNF-α等炎癥因子的大量釋放，造成腸組織損傷。鑒于TLR4/NF-κB通路的異?；罨菍?dǎo)致UC腸組織持續(xù)炎癥的重要誘因，故該通路被認(rèn)為是治療UC的重要靶標(biāo)[3，4]。

UC在中醫(yī)上屬于“痢疾”、“泄瀉”、“腹痛”等范疇，其病機(jī)涉及脾氣虛弱、運(yùn)化失調(diào)，故治法常采用健脾益氣、滲濕止瀉。參苓白術(shù)散出自《太平惠民合劑局方》，由人參、茯苓、白術(shù)、山藥、蓮子肉、薏苡仁、 白扁豆、砂仁、桔梗、甘草十味中藥組成，主治脾虛證。大量臨床實(shí)踐表明，參苓白術(shù)散治療UC療效顯著，但其作用機(jī)制尚不清楚[5，6]。本研究擬從TLR4/NF-κB通路角度探討參苓白術(shù)散治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性健康昆明種小鼠，體質(zhì)量(34±2)g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2016-0010。

1.1.2藥品與試劑 參苓白術(shù)散購(gòu)于山西華康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 Z14020346；美沙拉嗪購(gòu)于上海愛(ài)的發(fā)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143164；DSS(美國(guó)MP Biomedicals公司，批號(hào)S0433)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京Leagene生物科技有限公司，編號(hào)DH0006)；大便隱血檢測(cè)試劑盒(安徽深藍(lán)醫(yī)療科技股份有限公司，批號(hào)皖20152400174)；小鼠 TNF-α、IL-10、MIF、EGF 定量酶聯(lián)免疫吸附試劑測(cè)定(ELISA)試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司，批號(hào)06/2019)；免疫組化試劑盒SABC即用型、DAB顯色試劑盒(博士德生物科技有限公司，批號(hào)分別是14E14L24C2722、14A18B22)；NF-κB、TLR4抗體(博士德生物科技有限公司，批號(hào)26j7543、16c5074)。

1.1.3儀器 BX51顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，H1-16KR型冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司)，Thermo Labserv K3型酶標(biāo)儀(上海沃元科技有限公司)，YD-6L生物組織冷凍包埋機(jī)、YD-315輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、YD-AB攤烤片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組及給藥[6]60只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、美沙拉嗪組、參苓白術(shù)散低、中、高劑量組，每組10 只。除正常組外，小鼠飲用3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液1周造成UC模型。造模成功后按體表面積法，參苓白術(shù)散高、中、低劑量組給予劑量分別是31.2、15.6、7.8 g/kg，空白組和模型組小鼠按 20 ml/kg給予生理鹽水；美沙拉嗪組按0.40 g/kg 給予美沙拉嗪片劑水溶液；灌胃1次/d，共14 d。動(dòng)物飼養(yǎng)期間自由飲食及飲水。

1.2.2標(biāo)本采集 禁食24 h的小鼠經(jīng)3.5% 水合氯醛麻醉后眼球取血，采血后處死動(dòng)物并取整段結(jié)腸測(cè)量長(zhǎng)度。在結(jié)腸病變處截取1～2 cm 投入4%多聚甲醛溶液固定，剩余結(jié)腸組織凍存管分裝，-80℃冰箱保存。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1小鼠一般情況及DAI評(píng)分[6]治療周期結(jié)束后，觀察各組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、毛色光澤、腹瀉、黏液便、血便等一般情況；對(duì)小鼠進(jìn)行 DAI 評(píng)分，包括體質(zhì)量、大便性狀、隱血情況(隱血便試紙法)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)由體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)、大便性狀分?jǐn)?shù)、便血分?jǐn)?shù)三部分組成，計(jì)算公式： DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。

1.2.3.2結(jié)腸長(zhǎng)度、質(zhì)量 取材時(shí)準(zhǔn)確測(cè)量結(jié)腸自然長(zhǎng)度及稱(chēng)量質(zhì)量。

1.2.3.3結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 結(jié)腸組織由多聚甲醛固定后酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，包埋后中性樹(shù)脂封片，在切片機(jī)上切成 4 μm厚度組織片，進(jìn)行 HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸形態(tài)和病理?yè)p傷。

1.2.3.4ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、MIF、IL-10、EGF含量 取血后室溫靜置1 h，再于離心機(jī)上3 000 r/min離心10 min，取上清液。嚴(yán)格按照 ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、MIF、IL-10、EGF 水平。于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定 OD值，計(jì)算樣品濃度。

1.2.3.5免疫組化法觀察結(jié)腸病理組織中NF-κB和TLR4的表達(dá) 取制好的蠟塊，切4 μm厚的石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟，梯度75%乙醇水化，PBS水洗后滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，檸檬酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)后，自然冷卻，滴加5% 封閉液封閉20 min。每張切片滴加一抗NF-κB或TLR4，4℃孵育過(guò)夜，PBS緩沖液沖洗后滴加生物素化羊抗兔 IgG，37℃孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗后滴加試劑SABC，37℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗。室溫DAB顯色，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察結(jié)腸組織中 NF-κB 和 TLR4 的表達(dá)情況，并用 Image J軟件計(jì)算平均光密度。

2 結(jié)果

2.1參苓白術(shù)散對(duì)UC小鼠一般情況及DAI評(píng)分的影響 與空白組相比，模型組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、豎毛、毛色失去光澤、大便稀、有血便及黏液便、大便潛血為陽(yáng)性，體質(zhì)量減輕。見(jiàn)圖1。參苓白術(shù)散低、中、高劑量組小鼠的上述癥狀較模型組有不同程度減輕。與空白組相比，模型組小鼠DAI評(píng)分顯著升高(P<0.01)；給藥第一周與模型組比較，各給藥組均有不同程度減輕，DAI評(píng)分降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；給藥第二周與模型組比較，參苓白術(shù)散劑量中劑量組與美沙拉嗪組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。DAI 評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1 。

2.2參苓白術(shù)散對(duì)UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和重量的影響 與空白組比較，模型組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度整體上縮短顯著且單位結(jié)腸重量明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，參苓白術(shù)散低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度改善趨勢(shì)顯著(P<0.01)，單位結(jié)腸重量上，除低劑量組無(wú)明顯差異，余下各組降低顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3參苓白術(shù)散對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響 與空白組比較，模型組結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，腺體排列損傷嚴(yán)重，層次不清，隱窩結(jié)構(gòu)異常，不同程度出現(xiàn)隱窩分支及扭曲，隱窩數(shù)量減少，更有黏膜表面不平，杯狀細(xì)胞減少； 參苓白術(shù)散低、中劑量治療后，UC小鼠結(jié)腸黏膜病變有一定程度的改善，高劑量治療和美沙拉嗪治療后小鼠結(jié)腸黏膜病變改善更加明顯。見(jiàn)圖3。

圖1 各組小鼠體重變化

2.4參苓白術(shù)散對(duì)UC小鼠血清內(nèi) TNF-α、MIF、IL-10、EGF含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清內(nèi)TNF-α、MIF含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，參苓白術(shù)散中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清TNF-α 含量顯著降低(P<0.01)，其中參苓白術(shù)散低劑量組含量明顯下降，參苓白術(shù)散低、中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清內(nèi)MIF含量顯著降低(P<0.01)；與空白組比較，模型組小鼠血清內(nèi)IL-10、EGF含量降低顯著(P<0.01)，與模型組比較，參苓白術(shù)散中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清IL-10含量上升顯著(P<0.01)，參苓白術(shù)散低、中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清EGF含量上升顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖4 。

GroupDAIBeforeadministrationTreatmentfor 1 weekTreatmentfor 2 weekA0.17±0.280.22±0.350.17±0.28B2.06±0.831.78±0.831)1.78±0.581)C2.33±0.471.67±0.371.67±0.63D2.34±0.561.56±0.541.19±0.392)E2.39±0.441.67±0.601.57±0.28F2.28±0.531.50±0.621.17±0.382)

Note：A.Control group;B.Model group;C.High-dose Shenling Baizhu San;D.Middle-dose Shenling Baizhu San;E.Low-dose Shenling Baizhu San;F.Mesalazine group.Compared with the control group,1)P<0.01;compared with the model group,2)P<0.05.

圖2 各組小鼠結(jié)腸單位長(zhǎng)度與重量

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)變化(HE，×100)

圖4 各組小鼠血清中TNF-α、MIF、IL-10、EGF的水平

圖5 各組小鼠結(jié)腸NF-κB表達(dá)(DAB，×400)

圖6 各組小鼠結(jié)腸TLR4表達(dá)(DAB，×400)

2.5參苓白術(shù)散對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和TLR4表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組胞質(zhì)胞核可見(jiàn)棕黃色和褐色顆粒均有增加；與模型組相比，美沙拉嗪組和參苓白術(shù)散低、中、高劑量組胞質(zhì)胞核內(nèi)棕黃色和褐色顆粒均有明顯減少；與模型組相比，美沙拉嗪組和參苓白術(shù)散低、中、高劑量組 NF-κB 表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，美沙拉嗪組和參苓白術(shù)散中、高劑量組 TLR4 表達(dá)顯著減少(P<0.01)，參苓白術(shù)散低劑量組TLR4表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖5、6。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)在歐美發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率較高，在我國(guó)近年來(lái)發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，我國(guó)UC的患病率為11.6/10萬(wàn)[7]。目前，臨床上治療UC的藥物較多，但均表現(xiàn)出明顯的毒副作用，如5-氨基水楊酸可引起惡心、嘔吐、再生障礙性貧血、輕度急性胰腺炎等，糖皮質(zhì)激素可誘發(fā)股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松、感染等，免疫抑制劑具有肝毒性、胃腸道毒性、血小板數(shù)量下降、誘發(fā)腫瘤等，新型生物制劑(英夫利西單克隆抗體等)可導(dǎo)致藥物過(guò)敏、并發(fā)感染等[8]。而中藥通過(guò)其對(duì)機(jī)體的綜合調(diào)節(jié)，尤其是對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，在治療UC中發(fā)揮出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

正常情況下，腸道微生態(tài)對(duì)機(jī)體發(fā)揮多種重要的生理調(diào)節(jié)作用，其中來(lái)自菌體的抗原對(duì)廣泛分布于腸道的免疫細(xì)胞有一定的刺激作用，使后者產(chǎn)生一定種類(lèi)和數(shù)量的細(xì)胞因子，包括促炎因子和抗炎因子，兩類(lèi)因子保持著動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于維持腸道甚至全身的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。 大量證據(jù)表明，UC 發(fā)病過(guò)程中，出現(xiàn)細(xì)胞因子平衡被打破的現(xiàn)象，通過(guò)調(diào)節(jié)使平衡恢復(fù)，將會(huì)使UC緩解或痊愈，因此，糾正失衡的細(xì)胞因子被認(rèn)為是治療UC的重要手段[9]。

由腸黏膜固有層單核細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)在UC患者以及UC模型小鼠中含量均顯著升高。TNF通過(guò)結(jié)合相應(yīng)的受體TNFR1和TNFR2，激活胞內(nèi)NF-κB，誘導(dǎo)更多細(xì)胞因子的產(chǎn)生[10]?？?TNF-α單抗(英夫利昔)于2005年經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)進(jìn)入臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎，即充分顯示了良好的臨床有效性。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)由巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞分泌，能夠抑制巨噬細(xì)胞游走，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥部位聚集，并進(jìn)一步激活其他細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)還能促進(jìn)TLR4的表達(dá)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體黃芩苷(Baicalin)能緩解大鼠UC，與其抑制MIF表達(dá)、下調(diào)巨噬細(xì)胞數(shù)量以及巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子MCP-1、MIP-3α有關(guān)[12]。鑒于TNF與MIF在致UC過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此阻斷TNF或MIF能改善UC患者或UC動(dòng)物模型的癥狀，因此，TNF或MIF被認(rèn)為是治療UC的重要靶標(biāo)。

IL-10是一種多源性細(xì)胞因子，在腸道主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌，對(duì)TNF-α、IL-6和IL-1等其他促炎因子有抑制作用，是一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的抗炎細(xì)胞因子。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)顯示，IL-10或IL-10R等位基因突變與UC發(fā)生存在很強(qiáng)關(guān)聯(lián)，提示IL-10在抗UC中的重要作用[13]。表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)可通過(guò)刺激細(xì)胞代謝和增生有助于潰瘍部位損傷的修復(fù)，也是抗UC的重要因子[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一定劑量的參苓白術(shù)散治療能明顯改善UC小鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、DAI評(píng)分及結(jié)腸組織學(xué)病變，抑制促炎因子TNF-α和MIF表達(dá)，同時(shí)上調(diào)抗炎因子IL-10與EGF的表達(dá)，表明參苓白術(shù)散可以通過(guò)糾正上述細(xì)胞因子失衡而發(fā)揮治療UC的作用。

TLR4是TLRs家族中的重要成員，通過(guò)識(shí)別相應(yīng)的PAMP，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。NF-κB被激活后，調(diào)控一系列免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。研究表明，UC時(shí)NF-κB高度活化，并引發(fā)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)異常，導(dǎo)致促炎因子/抗炎因子平衡失調(diào)，從而引起腸道黏膜免疫炎癥性損傷[15]。TLR4在正常人體腸道黏膜中少量表達(dá)，但在 UC 患者或UC模型小鼠的腸黏膜中往往大量表達(dá)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在參苓白術(shù)散的干預(yù)下，TLR4與NF-κB出現(xiàn)明顯的下調(diào)。因此，我們推測(cè)參苓白術(shù)散對(duì)上述細(xì)胞因子失衡的糾正可能與調(diào)整TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

參苓白術(shù)散是復(fù)方中藥，成分復(fù)雜，其確切的抗UC組分及詳細(xì)的作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究，這些問(wèn)題的闡明將為其開(kāi)發(fā)成為潛在的抗UC藥物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。