楊 瀅 李作孝 (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,瀘州 646000)

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)是一種典型的自身免疫性神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病特征為外周促炎細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并導(dǎo)致多灶性炎性脫髓鞘。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)是MS的理性動(dòng)物模型。在自身免疫過(guò)程中，細(xì)胞自噬與固有免疫及適應(yīng)性免疫緊密關(guān)聯(lián)，有研究顯示細(xì)胞自噬直接參與MS或者EAE的進(jìn)展[1]。銀蓮花素A(raddeanin A，RA)，又名竹節(jié)香附素A，是中藥兩頭尖提取出的三萜皂苷，近來(lái)研究證明其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬等作用[2]。RA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的研究中，通過(guò)透射電鏡觀察及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)，顯示RA可能通過(guò)調(diào)控p38MAPK/mTOR通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[3]。本研究通過(guò)觀察RA對(duì)EAE小鼠發(fā)病情況、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白以及p38MAPK、mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)變化的影響，探討其對(duì)EAE小鼠自噬的調(diào)控及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C57BL/6小鼠60只，體重18～22 g，周齡6～8周，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、EAE模型組及RA低、中、高劑量組，每組12只。

1.1.2藥品及主要試劑 竹節(jié)香附素A(中國(guó)食品藥品檢定研究所)，MOG35-55多肽(上海吉爾生化有限公司)，結(jié)核分枝桿菌H37Ra(上海瑞楚生物科技有限公司)，百日咳毒素(美國(guó)sigma公司)，Luxol Fast Blue染液試劑盒(ASPEN公司)，DAPI染液(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司)，兔抗小鼠p-p38抗體、兔抗小鼠多克隆微管相關(guān)蛋1輕鏈3B(LC3B)抗體(CST公司)，兔抗小鼠 p-mTOR、p-p70S6K抗體(abcam公司)，山羊抗兔HRP(ASPEN公司)。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備及處理 將MOG35-55溶于PBS(0.01 mmol/L)，濃度為2 mg/ml，TB溶于CFA，濃度為10 mg/ml[4]。將上述兩組液體充分混合，通過(guò)三通管冰浴快速反復(fù)雙向推送，直至形成油包水狀態(tài)，分別對(duì)EAE模型組及RA低、中、高劑量組小鼠于兩前肢、兩后肢與脊柱連線處皮下注射(每只0.2 ml)。免疫當(dāng)天為第0天,于第0、2天給造模小鼠每只腹腔注射PTX 0.2 ml(0.5 μg)。自免疫日起，RA低劑量、中劑量、高劑量組分別腹腔注射RA 0.05、0.1、0.2 mg/kg，每日注射一次，連續(xù)10 d。空白對(duì)照組、模型組每日腹腔注射等量生理鹽水。各EAE小鼠于發(fā)病高峰期處死取材，空白對(duì)照組觀察4周處死取材。

1.2.2各組小鼠發(fā)病情況觀察 自免疫日起至第28天，遵循雙盲原則，每日同一時(shí)間(上午9：00) 由同一人觀察各組小鼠的臨床癥狀、神經(jīng)功能缺損評(píng)分，用Weaver 15分法：①尾巴：無(wú)癥狀0分，張力減低或遠(yuǎn)端癱瘓1分，全癱2分；②四肢：無(wú)癥狀0分，步態(tài)不穩(wěn)計(jì)1分，輕癱、行走時(shí)搖曳2分，全癱、行走時(shí)外翻計(jì)3分；③死亡計(jì)15 分。尾部和四肢的評(píng)分相加得總分。

1.2.3組織病理LFB染色 4%多聚甲醛灌流體內(nèi)組織固定，分離脊髓組織，4%多聚甲醛充分固定48 h，石蠟包埋，制備厚度6 μm切片，取切片脫蠟、脫水，放入Luxol Fast Blue染液中60℃水浴中24 h，分化、風(fēng)干、封片。

1.2.4免疫熒光檢測(cè)LC3蛋白表達(dá) 取脊髓組織石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2 h，脫蠟水化，抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS洗滌5 min×3次，于3%過(guò)氧化氫溶液中室溫下避光孵育10 min，5% BSA封閉20 min，每張切片加入約50 μl一抗兔抗LC3(1∶50)，4℃過(guò)夜。次日，PBS洗去一抗，每張切片加50 μl～100 μl CY3標(biāo)記山羊抗兔(1∶50)，37℃孵育50 min，經(jīng)PBS洗滌每張切片加50～100 μl DAPI染液，室溫避光孵育5 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加抗熒光淬滅劑，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5Western blot檢測(cè)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-p38MAPK、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表達(dá) 冰上快速取小鼠脊髓組織，并提取蛋白，BAC法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、分離、轉(zhuǎn)模封閉，加入一抗LC3(1∶1 000)、p-p38MAPK(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、p-p70S6K(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)，4℃孵育過(guò)夜；次日洗滌后加入二抗HRP-Goat anti Rabbit(1∶10 000)，室溫孵育30 min，用TBST 在室溫下?lián)u床上洗5 min×3次。洗膜后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影、定影，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠發(fā)病情況 空白對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)癥狀。EAE模型組及RA低、中、高劑量組出現(xiàn)不同程度發(fā)病，起初精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、攝食減少及體重下降等，逐漸出現(xiàn)尾部張力下降、共濟(jì)失調(diào)、大小便失禁，嚴(yán)重者出現(xiàn)四肢癱瘓。各組小鼠未出現(xiàn)死亡。與EAE模型組對(duì)比，RA各劑量組小鼠發(fā)病潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01)，進(jìn)展期縮短(P<0.05或P<0.01)，發(fā)病高峰期神經(jīng)功能評(píng)分下降(P<0.05或P<0.01)，隨著RA劑量增加作用明顯，且RA各劑量組間兩兩比較P均<0.05。各組間差別見(jiàn)表1。

2.2各組小鼠脊髓組織LC3分布情況(見(jiàn)圖1) 空白對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯脫髓鞘，EAE模型組、RA低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠白質(zhì)可見(jiàn)大小不等的片狀髓鞘脫失區(qū)域。EAE模型組髓鞘脫失最明顯，并存在大量空泡化改變，RA藥物干預(yù)組脫髓鞘情況較輕，空泡化程度較低，且隨著劑量的增加，脫髓鞘的情況逐漸減輕。

GroupsIncubationperiod(d)Progressperiod(d)Neurological deficit scoresin peak onset in miceBlank control group--0EA model group10.17±2.417.67±1.238.17±1.64RA low dose group13.58±2.112)6.25±1.421)6.83±1.701)RA medium dose group15.83±1.852)3)4.58±1.622)3)4.58±1.442)3)RA high dose group17.92±1.172)3)4)3.42±1.172)3)4)2.57±1.072)3)5)

Note:Compared with EAE model group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with RA low dose group,3)P<0.01;compared with RA medium dose group,4)P<0.05,5)P<0.01.

圖1 各組小鼠脊髓組織脫髓鞘情況比較(LFB染色×200)

2.3各組小鼠脊髓組織LC3分布情況(見(jiàn)圖2) EAE模型組LC3散亂分布無(wú)明顯點(diǎn)狀聚集現(xiàn)象，RA藥物干預(yù)組小鼠神經(jīng)元LC3表達(dá)增強(qiáng)，可見(jiàn)點(diǎn)狀陽(yáng)性亮點(diǎn)，且隨著藥物劑量增加，LC3表達(dá)增強(qiáng)。

2.3各組小鼠脊髓組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值 空白對(duì)照組、EAE模型組、RA低、中、高劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值分別是0.529±0.059、0.245±0.027、0.308±0.046、0.412±0.048、0.467±0.043。與空白對(duì)照組比，EAE模型組脊髓組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值下降(P<0.05)。與EAE模型組相比，RA低、中、高、劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值均升高，隨著RA劑量增加作用越明顯，且RA各劑量組間兩兩比較P均<0.05。見(jiàn)圖3、4。

圖2 各組小鼠脊髓組織LC3免疫熒光分布情況(×200)

圖3 各組小鼠脊髓組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)(n=6)

圖4 各組小鼠脊髓組織LC3、p-P38、p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)對(duì)比(Western blot)

Groupsp-p38MAKPp-mTORp-p70S6KBlank control group 0.026±0.0070.149±0.0290.065±0.018EA model group0.600±0.0141)0.671±0.0451)1.122±0.0871)RA low dose group0.277±0.0281)2)0.566±0.0451)2)0.688±0.0471)2)RA medium dose group0.125±0.0221)2)3)0.377±0.0601)2)3)0.345±0.0451)2)3)RA high dose group0.051±0.0191)2)3)4)0.280±0.0531)2)3)4)0.144±0.0121)2)3)4)

Note:Compared with the blank control group,1)P<0.05;compared with the EAE model group,2)P<0.01;compared with the RA low dose group,3)P<0.01;compared with the RA medium dose group,4)P<0.01.

2.3各組小鼠脊髓組織p-p38MAKP、p-mTOR、p-p70S6K通路蛋白的表達(dá) 與空白對(duì)照組對(duì)比，EAE模型組脊髓組織p-P38MAKP、p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)與EAE模型組對(duì)比，RA低、中、高、劑量組脊髓組織p-P38MAKP、p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)下降，隨著RA劑量增加作用明顯，且RA各劑量組間兩兩比較P均<0.01。見(jiàn)表2。

3 討論

既往研究表明，自噬作為降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的生物過(guò)程，可通過(guò)其免疫調(diào)節(jié)作用參與淋巴細(xì)胞的生成與維持、異物的清除、抗原遞呈及對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控，與MS的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[5]。誘導(dǎo)自噬可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，維持血腦屏障功能完整，減輕脫髓鞘，延緩MS或EAE病情進(jìn)展。LC3是一種與自噬體形成相關(guān)的微管結(jié)合蛋白，是自噬的標(biāo)志性蛋白，主要控制自噬途徑的步驟包括自噬膜的生長(zhǎng)、自噬貨物的識(shí)別及自噬體與溶酶體的融合[6]。LC3存在兩種形式，細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3經(jīng)過(guò)加工，成為胞質(zhì)可溶形式的LC3Ⅰ，經(jīng)過(guò)泛素樣系統(tǒng)的脂化，形成膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ。LC3Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，隨著自噬體膜的增多而增多。因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，為自噬水平的指標(biāo)[7]。本研究顯示與空白對(duì)照組對(duì)比，EAE模型組脊髓組織LC3散亂分布無(wú)明顯點(diǎn)狀聚集現(xiàn)象，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，提示EAE在發(fā)病高峰期自噬水平降低。

P38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的重要組成部分，已有4種p38亞型被發(fā)現(xiàn)，主要在細(xì)胞應(yīng)激、炎性刺激時(shí)可被磷酸化激活，進(jìn)而引發(fā)下游效應(yīng)分子的激活[8]。既往研究顯示應(yīng)用p38α/β抑制劑可減輕EAE小鼠的癥狀，延緩病程進(jìn)展[9]。P38MAPK是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路，在炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬、衰老等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。自噬相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)依賴的通路(PI3K/Akt/mTOR，AMPK/mTOR，MAPK/mTOR通路)，和非TOR依賴的通路。mTOR是自噬誘導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過(guò)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可活化mTOR，進(jìn)而抑制自噬[11]。mTOR可通過(guò)刺激活化其下游的p70S6K，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、增殖及生長(zhǎng)[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示與空白對(duì)照組、EAE模型組p38MAPK、mTOR、p70S6K磷酸化比較對(duì)照組有所增高。表明EAE小鼠脊髓組織發(fā)病高峰存在自噬缺陷，可能與p38MAPK、mTOR、p70S6K通路蛋白磷酸化有關(guān)。

三萜皂苷廣泛分布于自然界，大多數(shù)以游離態(tài)或與糖成苷類或成酯存在，含有三萜皂苷類成分的中藥主要有人參、柴胡等，在眾多的三萜類化合物中有一類化合物具有獨(dú)特的生物活性，即齊墩果酸型皂苷，有抗腫瘤、降血糖、降血脂等諸多藥理活性[13]。RA是兩頭尖中提取出的齊墩果酸皂苷之一，以齊墩果烷為母核，以葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖為糖連接成苷，具有較高的含量，有著極好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值[14]。RA有較強(qiáng)抗腫瘤作用，目前發(fā)現(xiàn)RA能抑制肺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬。在對(duì)腸癌細(xì)胞HCT116的研究中，顯示RA干預(yù)后電鏡下可見(jiàn)自噬小體形成，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Belin-1、ATG5、ATG12表達(dá)上調(diào)，且p-mTOR蛋白表達(dá)下降[15]。本研究應(yīng)用銀蓮花素A干預(yù)EAE小鼠，藥物干預(yù)組發(fā)病潛伏期延長(zhǎng)，進(jìn)展期縮短，神經(jīng)功能評(píng)分降低，且呈劑量依賴關(guān)系，病理學(xué)顯示脫髓鞘情況改善，提示RA對(duì)EAE小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，與EAE模型組對(duì)比，RA各干預(yù)組小鼠發(fā)病高峰期脊髓組織LC3表達(dá)增強(qiáng)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有所提升，而p-p38MAPK、p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)有所下降，且呈劑量依賴關(guān)系，提示RA可上調(diào)EAE小鼠發(fā)病高峰期脊髓組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制p38MAPK/mTOR通路蛋白激酶磷酸化，但本實(shí)驗(yàn)未通過(guò)上調(diào)或下調(diào)通路活化，未準(zhǔn)確的指出RA調(diào)控p38MAPK通路的靶點(diǎn)，為本實(shí)驗(yàn)不足之處，該藥的特異性也值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，銀蓮花素A能改善EAE小鼠發(fā)病情況及脫髓鞘情況，且呈劑量依賴關(guān)系。其作用機(jī)制可能是RA通過(guò)調(diào)控p38MAPK蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)mTOR蛋白、p70S6K蛋白激酶抑制，上調(diào)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，通過(guò)清除胞質(zhì)中受損細(xì)胞器及蛋白起到保護(hù)細(xì)胞作用，抑制炎癥反應(yīng)，減輕脫髓鞘情況，改善EAE小鼠病情進(jìn)展。