唐 標(biāo) 尹抗抗 (湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410028)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球激增的健康問(wèn)題，是肝臟疾病和心血管代謝疾病死亡的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[1]。部分NAFLD患者會(huì)進(jìn)展為肝炎、肝纖維化和肝硬化，最終發(fā)展為肝癌、肝衰竭，NAFLD的發(fā)病機(jī)制與脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)蓄積、胰島素抵抗、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及炎癥等多種因素有關(guān)[2,3]。

細(xì)胞焦亡是一種炎癥相關(guān)的可調(diào)控性細(xì)胞死亡方式，gasdermin D(GSDMD)蛋白是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行分子，GSDMD被活化剪切生成的GSDMD的N端(GSDMD-N)會(huì)形成聚合物并與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)分子形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂，釋放大量促炎因子，加重炎癥反應(yīng)[4]。GSDMD的活化由Caspase-1/4/5/11介導(dǎo)，Caspase-4/5為大鼠和小鼠種屬Caspase-11在人體中的同源蛋白，由Caspase-1活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，為經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑；而由脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的Caspase-4/5/11活化而誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑[5,6]。已有研究揭示細(xì)胞焦亡介導(dǎo)了NAFLD中肝細(xì)胞的死亡以及加重炎癥反應(yīng)和纖維化的進(jìn)程，成為NAFLD干預(yù)的重要靶點(diǎn)[7,8]。

降脂理肝湯由澤瀉、丹參、決明子、郁金、海藻和荷葉6味中藥組成。臨床觀(guān)察和實(shí)驗(yàn)研究表明，降脂理肝湯能有效干預(yù)NAFLD[9]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，降脂理肝湯能調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠脂代謝，抑制炎癥反應(yīng)，減輕肝臟病理?yè)p傷，并且能抑制NLRP3炎癥小體的活化[10-12]。但是降脂理肝湯在NAFLD中的抗炎機(jī)制以及非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑是否介導(dǎo)其抗炎機(jī)制還不明確，因此本研究觀(guān)察降脂理肝湯對(duì)NAFLD中非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑的影響，探討降脂理肝湯干預(yù)NAFLD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物 降脂理肝湯由澤瀉10 g，決明子30 g，丹參10 g，郁金10 g，海藻30 g，荷葉10 g組成，中藥飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)陳曉陽(yáng)教授鑒定為治療標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合要求的藥材。上述藥物加8倍量水浸泡30 min 后，沸后煎煮1 h后過(guò)濾，再加6倍量水沸后煎煮1 h過(guò)濾，兩次藥液混合，于65℃減壓旋蒸濃縮，濃縮成2 g/ml的濃縮液，于4℃冷藏儲(chǔ)存，臨用前用生理鹽水稀釋成所需濃度。

1.1.2動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(150±10)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK(湘)2017-0003。實(shí)驗(yàn)前，在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室溫度(22±2)℃，自然晝夜節(jié)律光照，自由進(jìn)水?dāng)z食。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.1.3試劑 水合氯醛(批號(hào)：8MQ20-CC)購(gòu)自梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液(批號(hào)：P0013)購(gòu)自碧云天；蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA，100 × DMSO儲(chǔ)液，批號(hào)：B14002)，磷酸酶抑制劑Cocktail (100×B15002，批號(hào)：B15002)購(gòu)自Bimake；大鼠IL-1β ELISA試劑盒(批號(hào)：GN-R30172)、大鼠L-18 ELISA試劑盒(批號(hào)：GN-R30168)、大鼠TNF-α ELISA試劑盒(批號(hào)：GN-R31092)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(批號(hào)：GN-R30201)購(gòu)自蓋寧生物；LPS檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：H178)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；GSDMD鼠單克隆抗體(批號(hào)：sc-393581)、Caspase-11(批號(hào)：sc-374615)鼠單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechno-logy；GSDMD-N兔單克隆抗體(批號(hào)：93709)購(gòu)自Cell Signaling Technology；β-actin鼠抗單克隆抗體(批號(hào)：A5316)購(gòu)自Sigma；山羊抗兔二抗(批號(hào)：AP132P)、山羊抗鼠二抗(批號(hào)：AP124P)購(gòu)自Merck。

1.1.4儀器 酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1NAFLD大鼠模型的建立 參照前期研究[13]，采用高脂飼料喂養(yǎng)12周的方法建立NAFLD大鼠模型，高脂飼料配方：脂肪10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉5%，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料82.5%，高脂飼料由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2.2動(dòng)物分組和藥物干預(yù) SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、降脂理肝湯組，其中降脂理肝湯給藥劑量參照前期研究，按照動(dòng)物與人體間的等效劑量換算，設(shè)3個(gè)劑量，分別為降脂理肝湯低劑量組(2.3 g/kg)、降脂理肝湯中劑量組(4.6 g/kg)和降脂理肝湯高劑量組(9.2 g/kg)。正常組標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組和降脂理肝湯高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)12周后，每組隨機(jī)抽取3只，取肝組織蘇木精-伊紅染色(HE染色)，觀(guān)察組織病理學(xué)變化，觀(guān)察到高脂飼料肝臟出現(xiàn)不同程度的脂肪變性和空泡樣變，驗(yàn)證模型成功后，進(jìn)行藥物干預(yù)，降脂理肝湯采用灌胃給藥的方式，均1次/d。連續(xù)6周，每周稱(chēng)重1次，按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。正常組和模型組每天灌胃給予等量的生理鹽水，藥物干預(yù)期間，喂養(yǎng)方式同前。干預(yù)結(jié)束后，取各組大鼠肝門(mén)靜脈和腹主動(dòng)脈血液和肝臟待檢測(cè)。

1.2.3Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量 每組5只大鼠，取大鼠同部位肝臟組織100 mg，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液1 ml于冰上勻漿30 min，提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)平各樣品蛋白濃度。取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用抗GSDMD(1∶1 000)、GSDMD-N(1∶1 000)、Caspase-11(1∶500)和β-actin(1∶5 000)一抗抗體4℃孵育過(guò)夜，洗滌后加HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗滌后ECL顯色曝光，用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行圖像定量分析，測(cè)定目的蛋白的相對(duì)光密度值(IOD)，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白IOD與內(nèi)參蛋白IOD的比值，以此表示蛋白表達(dá)量。

1.2.4門(mén)靜脈血清LPS水平檢測(cè) 門(mén)靜脈血液靜置離心后提取血清，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，首先向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生物標(biāo)記的識(shí)別抗原，于37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入親和素HRP，于37℃孵育1 h，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)孔吸光值及其對(duì)應(yīng)濃度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各組血清中LPS的濃度。

1.2.5血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平檢測(cè) 大鼠腹主動(dòng)脈血液靜置離心后提取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒于室溫下平衡20 min后，將稀釋好的樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100 μl/孔加入相應(yīng)孔中，每孔設(shè)置1復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置本底校正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液，用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min后，洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干，加入生物素化抗體100 μl/孔，封孔后室溫孵育60 min，洗板5次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記100 μl/孔，室溫避光孵育20 min，洗板5次，加入顯色劑TMB溶液100 μl/孔，室溫避光孵育20 min，加入終止液50 μl/孔，混勻后立即測(cè)量A450值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)樣品吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織GSDMD蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，高脂飲食誘導(dǎo)的模型組大鼠肝組織GSDMD和GSDMD-N蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；降脂理肝湯藥物干預(yù)后，大鼠肝組GSDMD和GSDMD-N蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織Caspase-11蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織Caspase-11蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯藥物組肝組織Caspase-11蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠肝門(mén)靜脈血清中LPS水平的影響 與正常組相比，高脂飲食誘導(dǎo)的模型組大鼠肝門(mén)靜脈血清LPS水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯藥物的干預(yù)均能顯著降低大鼠肝門(mén)靜脈血清LPS水平，并呈劑量依賴(lài)性(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3降脂理肝湯對(duì)NAFLD大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯藥物組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖1 降脂理肝湯對(duì)大鼠肝組織GSDMD蛋白表達(dá)的影響

圖2 降脂理肝湯對(duì)大鼠肝組織Caspase-11蛋白表達(dá)的影響

圖3 降脂理肝湯對(duì)大鼠肝門(mén)靜脈血清LPS的影響

圖4 降脂理肝湯對(duì)大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平的影響

3 討論

前期的實(shí)驗(yàn)研究揭示，降脂理肝湯可降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠體重、肝重和肝指數(shù)，調(diào)節(jié)脂代謝，改善脂質(zhì)過(guò)氧化，改善肝功能和肝臟病理?yè)p傷，其機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控腸道菌群有關(guān)[10-14]。

炎癥反應(yīng)作為NAFLD發(fā)病機(jī)制的核心環(huán)節(jié)在NALFD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，細(xì)胞焦亡介導(dǎo)了NAFLD中的炎癥反應(yīng)，成為NAFLD干預(yù)的重要靶點(diǎn)[8]。已有的研究揭示，GDSMD蛋白作為細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白，介導(dǎo)了NAFLD進(jìn)展過(guò)程，GSDMD蛋白被剪切活化后生成GSDMD-N，GDDMD-N導(dǎo)致細(xì)胞穿孔腫脹破裂，釋放大量促炎因子，加重炎癥反應(yīng)，抑制GDSMD的活化能阻斷NAFLD疾病的進(jìn)展[15]。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠，GSDMD蛋白及其活化后的GSDMD-N表達(dá)明顯增加，而降脂理肝湯的干預(yù)能降低GSDMD和GSDMD-N的水平，表明降脂理肝湯能調(diào)控GSDMD的活化。

在非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑中，LPS可直接活化的Caspase-4/5/11，活化Caspase-4/5/11剪切GDSMD誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟組織中，Caspase-11的水平明顯升高，而降脂理肝湯的干預(yù)能降低能顯著降低Caspase-11的水平，提示降脂理肝湯可能通過(guò)Caspase-11來(lái)調(diào)控GSDMD蛋白的活化。已有研究表明在NAFLD中腸道菌群的紊亂以及腸道黏膜的受損可導(dǎo)致腸道內(nèi)革蘭氏陰性桿菌溶解釋放的LPS進(jìn)入門(mén)靜脈血液加重NAFLD肝臟炎癥和加快疾病進(jìn)展[16-18]。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝門(mén)靜脈血清中LPS含量顯著升高，而降脂理肝湯的干預(yù)能顯著降低大鼠肝門(mén)靜脈血清中LPS含量，我們前期實(shí)驗(yàn)研究揭示，降脂理肝湯能調(diào)控NAFLD大鼠腸道菌群，修復(fù)腸黏膜損傷，減少LPS入血[13,19]，提示降脂理肝湯可能通過(guò)降低NAFLD大鼠門(mén)靜脈血清中LPS含量，調(diào)控Caspase-11和GSDMD的活化。

細(xì)胞焦亡的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致IL-1β和IL-18等促炎因子的釋放，而促炎因子會(huì)加重NAFLD中的炎癥反應(yīng)[20,21]。因此我們進(jìn)一步觀(guān)察了降脂理肝對(duì)血清中促炎因子的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂飲食的NAFLD大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平明顯升高，而降脂理肝湯的干預(yù)能顯著降低血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的水平，這提示降脂理肝湯能降低NAFLD大鼠促炎因子的水平。

本研究結(jié)果顯示高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠，存在非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑的活化，IL-1β和IL-18等促炎因子水平明顯升高，而降脂理肝湯能抑制NAFLD大鼠中非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑的活化，降低促炎因子的水平，近期有研究揭示抑制細(xì)胞焦亡能有效減輕NAFLD損傷以及抑制非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑能有效干預(yù)酒精性肝炎的進(jìn)展[22，23]，提示降脂理肝湯可能通過(guò)調(diào)控非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑干預(yù)NAFLD。

綜上所述，降脂理肝干預(yù)NAFLD的機(jī)制可能與抑制非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑，降低促炎因子的水平有關(guān)。