秦力維，廖強華，石 芊，彭秀軍，曹利群，高 原，郭建巍，陳昌國，陳秋圓，馬志家

角膜病變是眼科第三大致盲性疾病，其中病毒性角膜炎是臨床常見的一類眼疾[1]。近年來，隨著廣譜抗生素和皮質類固醇激素的廣泛及不合理使用，該病發(fā)病率呈上升趨勢。由于皰疹病毒可長期潛伏在宿主體內并反復發(fā)作，角膜病變由淺至深，反復遷延，嚴重者可造成角膜白斑，使視力明顯下降甚至失明，加強對病毒性角膜炎的診療具有重要意義。作者對臨床診斷為病毒性角膜炎的患者淚液或角膜上皮細胞，用熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)方法進行了檢測，根據檢測結果指導臨床調整治療方案，現將結果分析總結如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2016年1月—2018年12月在中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心就診臨床診斷為病毒性角膜炎、未用過任何抗病毒藥物、征詢患者同意愿意接受病原檢測的門診及住院患者共90例，其中男性44例(48.9%)，女性46例(51.1%)，性別差異無統計學意義(χ2=2.8，P=0.17)?；颊吣挲g20～80(46±12)歲。90例患者中首次發(fā)病就診患者38例，反復多次發(fā)作后就診患者52例。

1.2 臨床檢查及眼部分泌物的采集 用裂隙燈顯微鏡檢查患者的眼瞼、結膜、角膜、前房、虹膜、晶狀體情況。在未進行抗病毒藥物治療前用一次性塑料滴管吸取患者結膜囊內的分泌物約0.5 mL，對角膜病變比較深的患者用無菌刀片刮取角膜上皮細胞于含有0.5 mL生理鹽水的無菌試管中送檢。

1.3 病毒性角膜炎的診斷

1.3.1 病史 入組患者，發(fā)病時間1 d至數日，發(fā)病次數有首次也有反復多次發(fā)作，有感冒、勞累、過度用眼、外傷等誘因伴隨，部分患者有自滴消炎眼液、眼膏治療病史，但均未使用過任何抗病毒藥物治療。

1.3.2 癥狀 單眼或雙眼視力下降、畏光、流淚、眼紅、眼痛、異物感、眼瞼浮腫及分泌物增多等。

1.3.3 體征 結膜囊水樣及粘性分泌物增多，結膜充血，睫狀充血，角膜水腫，角膜呈各種類型病變：淺層點狀、樹枝狀、假樹枝狀、廣泛糜爛性上皮浸潤；水腫；上皮下浸潤；角膜基質灰白色不規(guī)則浸潤；上皮及基質熒光素染色陽性；角膜內皮皺褶；角膜后沉積物；角膜云翳或斑翳形成；角膜知覺減退；耳前淋巴結腫大等。

1.3.4 輔助檢查 角膜刮片、普通細菌及真菌培養(yǎng)。

1.4 儀器與試劑 單純皰疹病毒(herpessimplex virus,HSV)1型、HSV2、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus,VZV)、人巨細胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)和EB病毒(EB virus,EBV)熒光定量檢測試劑盒均購自中山大學達安基因股份有限公司，其中包括Taq聚合酶、PCR反應液(反應液中含有5種病毒的特異性熒光探針)、dNTP等；FQ-PCR儀為美國ABI公司7500。判定標準以核酸檢測水平大于1 000拷貝/mL為陽性。

1.5 實驗方法

1.5.1 核酸提取 取100 μL中加入50 μL DNA裂解液，振蕩混勻，100 ℃金屬浴 10 min，13 000 r/min離心5 min，上清液即為DNA模板。

1.5.2 FQ-PCR反應 用AXYGEN8聯排PCR管，依次加入反應液40 μL，Taq聚合酶3 μL，核酸模板2 μL，振蕩均勻后瞬時離心15 s。PCR反應條件為93 ℃ 2 min 93 ℃45 s，55 ℃ 60 s，10個循環(huán)；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 40個循環(huán)；收集熒光。

2 結果

2.1 病毒性角膜炎診斷和病毒核酸檢出情況 共收集臨床診斷為病毒性角膜炎患者90例，其中上皮型49例(54.4%)，基質型41例(45.6%)。上皮型患者中，女性26例(53.1%)，男性23例(46.9%)；基質型患者中，女性20例(48.7%)，男性21例(51.3%)。

90例病毒性角膜炎患者中有54例檢測出皰疹病毒核酸，檢出率為60%;首次檢出36例，多次檢出18例，首次發(fā)病和多次發(fā)病患者的病毒核酸檢出率差異比較具有統計學意義(χ2=31.2,P<0.001)。表1。

表1 首次發(fā)病與多次發(fā)病檢出率比較[n(%)]

49例上皮型皰疹性角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率為30.6%，41例基質型病毒性角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率為95.1%，上皮型角膜炎和基質型角膜炎患者的皰疹病毒核酸檢出率差異比較具有統計學意義(χ2=11.64,P<0.001)。表2。

表2 上皮型角膜炎與基質型角膜炎皰疹病毒核酸檢出率的比較[n(%)]

2.2 首次發(fā)作就診患者中皰疹病毒核酸的檢出情況 發(fā)病后首次就診的38名患者中有36人檢測出皰疹病毒核酸，檢出率為94.7%，檢出前3位的病毒依次為HSV1(23例)、EBV(6例)和HSV2(3例)。

2.3 多次發(fā)作后就診患者中皰疹病毒核酸的檢出情況 多次發(fā)作后就診的52名患者中有18名檢測出皰疹病毒核酸，檢出率為34.6%，主要的感染病毒為HSV1(13例)和HCMV(3例)。

2.4 不同類型的角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出情況 90名病毒性角膜炎患者中HSV占病毒檢出數的74.0%，基質型角膜炎中HSV1、EBV、HCMV、HSV2 4種病毒檢出率均高于上皮型角膜炎(圖1)。

圖1 不同類型的角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出情況

上皮型角膜炎中病毒檢出率和平均拷貝數HSV1(11/15，3.6×105)明顯高于HSV2(1/15，1.2×104)、EBV(1/15，6.1×103)、HCMV(1/15，3.2×103)和VZV(1/15，1.9×103)。

基質型角膜炎中病毒檢出率和平均拷貝數HSV1(25/39，5.7×105)明顯高于HSV2(3/39，3.8×104)、EBV(6/39，3.7×103)、HCMV(4/39，2.9×103)和VZV(1/39，1.7×103)。

3 討論

病毒性角膜炎可發(fā)生于任何年齡，多為單眼發(fā)病。診斷主要依據為反復發(fā)作的病史和眼部的臨床表現,由于技術和條件的限制，在相當長的時期內，實驗室無法為臨床提供精準的病原學檢測項目。隨著分子生物學技術的發(fā)展，現在可以用FQ-PCR快速檢測病毒性角膜炎患者眼部淚液及病變區(qū)角膜上皮細胞中5種病毒核酸，該方法特異性強、快速簡便，臨床醫(yī)生在檢測2 h后即可獲得檢測結果，避免了患者的等待時間，通過實驗可定量檢測出臨床分泌物標本中的5種皰疹病毒,檢測結果及病毒拷貝數為第1次的抗病毒治療提供了科學依據，醫(yī)生可以根據病毒類型和病毒拷貝數調整藥物劑量，為病毒性角膜炎的早期診斷、精準治療和治療過程中的動態(tài)檢測及療效評價提供了科學依據。

臨床常見的皰疹病毒感染主要有：人單純病毒性角膜炎、皰疹病毒引起的急性濾泡性結角膜炎、色素膜炎(包括急性視網膜壞死)和視網膜炎等。引起人病毒性角膜炎的皰疹病毒主要包括HSV1、HSV2、VZV、HCMV和EBV 5種。其中單純皰疹病毒性角膜炎發(fā)病率和致盲率均居角膜病首位，發(fā)病率有不斷增高的趨勢，是我國主要的致盲性眼病之一，占角膜盲的首位。我們研究結果顯示，90例病毒性角膜炎中，皰疹病毒核酸的檢出率為60.0%，5種皰疹病毒中HSV占病毒檢出數的74.0%，研究結果與文獻相一致[2]。

EBV為人類4型皰疹病毒，在宿主細胞內主要以潛伏和裂解2種形式存在[3]。90.0%以上成年人體內EBV抗體陽性，可保護機體避免再次感染同種病毒[4-5]。在機體抵抗力下降時，潛伏在靜息B淋巴細胞中的EBV重新活化，導致多種嚴重疾病的發(fā)生。本研究共發(fā)現8例由EBV引起的病毒性角膜炎，在所有患者的外周血單個核細胞中都檢測到了EBV核酸，血漿中均未檢出EBV核酸，可能與EBV的慢性潛伏和機體抵抗力下降有關。

HCMV是導致免疫力低下個體感染的重要病原體。人類感染HCMV后多表現為無癥狀潛伏感染，HCMV活化狀態(tài)與機體免疫系統的下降密切相關[6]。機體一旦感染HCMV，將長期或終身攜帶。本研究中共檢測到4例由HCMV引起的角膜炎，均為哺乳期女性，經進一步深入研究，在對應患者的乳汁和尿液中也均檢測到了HCMV，主要是由于哺乳期女性免疫力下降，自身交叉感染所致。所有男性患者樣本中均未檢測到HCMV。

VZV是一種致神經性疾病的人類皰疹病毒，通常在兒童身上引起水痘，水痘病愈后病毒長期潛伏于腦神經節(jié)、背根神經節(jié)等神經軸內。當人體免疫力下降時，潛伏的VZV被重新激活，經感覺神經纖維軸突下行至所支配的皮膚區(qū)，增殖后引起帶狀皰疹，本研究中共檢測到2例由VZV引起的病毒性角膜炎，2例患者在發(fā)病3個月內均有帶狀皰疹病史，病毒性角膜炎主要是由于對帶狀皰疹治療不徹底、機體免疫力降低，皰疹病毒液感染角膜所致。

基質型角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率為95.1%，高于上皮型角膜炎中皰疹病毒核酸的檢出率(30.6%)，并且基質型角膜炎中HSV1、EBV、HSV2、HCMV 4種病毒檢出率均高于上皮型角膜炎，說明基質型角膜炎中因病毒復制量大，浸潤角膜基質深層，病原檢出率高，建議在臨床治療中對基質型皰疹病毒角膜炎要加大抗病毒藥物的劑量和使用頻率，并輔助其他藥物治療，必要時使用左氧氟沙星滴眼液以防治細菌性角膜炎的發(fā)生。

臨床上治療病毒性角膜炎的方法很多。我們根據病毒的檢出情況和疾病分型進行個體化的精準治療。對上皮型的角膜炎我們先使用阿昔洛韋滴眼液滴雙眼，3/d，配合小牛血去蛋白提取物眼用凝膠，3/d。由于更昔洛韋生物利用度高，半衰期長達8 h，進入病毒感染細胞的速度快，在細胞中存留時間長，因此，本研究選用更昔洛韋進行基質型角膜炎的抗病毒治療。實踐證明，更昔洛韋眼用凝膠治療基質型角膜炎比阿昔洛韋滴眼液療效好，在角膜組織內停留時間長，滲透性高，對深層組織的角膜炎、角膜潰瘍治療效果要更快更深入，對病原學檢測中病毒拷貝量大侵害角膜組織深的角膜炎一定要足量使用，由于考慮抗病毒藥物本身對角膜的毒性作用，角膜營養(yǎng)保護類藥物也要同時使用。同時對于潰瘍侵及深基質層的患者除給予抗病毒治療外，還給予免疫抑制劑環(huán)孢素和左氧氟沙星滴眼液。環(huán)孢素主要是選擇性地抑制輔助淋巴細胞，治療病毒性角膜基質炎局部應用環(huán)孢素比皮質類固醇更有效[7]，局部應用環(huán)孢素能抑制皰疹性角膜炎的復發(fā)[8]，使用左氧氟沙星滴眼液也是考慮到患者局部免疫防疫能力低下，防治細菌性角膜炎。對嚴重感染者還需要進行阿昔洛韋全身的抗病毒治療。

研究結果顯示引起病毒性角膜炎的病原體除了常見的HSV1外，HSV2、EBV、HCMV和VZV感染均可以引起病毒性角膜炎。發(fā)病后首次就診的病毒性角膜炎患者中皰疹病毒核酸的檢出率為94.7%，明顯高于多次發(fā)作后就診的患者(檢出率為34.6%)，可能是首次發(fā)病患者感染局部病毒的復制比多次發(fā)病患者更為活躍。90例病毒性角膜炎患者中有54例檢測出皰疹病毒核酸，檢出率為60.0%。導致臨床診斷和實驗室診斷不一致的原因可能與患者感染病毒性角膜炎后就醫(yī)的及時性、臨床醫(yī)生取樣的精準性、病程的長短、病毒的多樣性、病毒復制所處的時期和病毒潛伏的狀態(tài)等因素有關。建議臨床診斷為病毒性角膜炎的患者應盡早使用FQ-PCR進行5種皰疹病毒核酸的檢測,并在急性期盡快使用抗病毒藥物,以阻止病毒復制,以免患者抵抗力下降合并細菌和真菌感染。

特別指出的是，上皮型和基質型角膜炎中HSV的檢出率和拷貝數明顯高于其他病毒檢出率和拷貝數。對HSV感染的患者要加大抗病毒藥物的劑量和適當延長治療周期，治療過程中定期進行病毒核酸檢測,以指導臨床用藥，連續(xù)3次檢測陰性可停用抗病毒藥物。

研究結果還提示，病毒性角膜炎的發(fā)生與皰疹病毒的全身感染密切相關，有些患者并無全身感染的跡象，但在外周血單個核細胞中發(fā)現了潛伏的病毒，這對感染者皰疹病毒相關疾病的防控提出了新的要求，值得相關學科醫(yī)生的關注，也值得進一步深入研究。