曹亞偉，桂百卉

據(jù)報(bào)道全世界每年約有450 000人死于乳腺癌[1]，其中雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體2均為陰性的乳腺癌稱為三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)，TNBC占乳腺癌的15%～20%，由于缺乏有效的靶向治療手段而成為死亡率最高的乳腺癌類型[2-5]，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)研制有效的治療藥物，提高癌癥治療效果意義重大。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類缺乏編碼蛋白質(zhì)功能、長度超過200個(gè)核苷酸的RNA，lncRNA在細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等生物學(xué)過程中起到了重要作用，隨著近年來高通量測(cè)序的發(fā)展，越來越多的功能性lncRNAs成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[6]，雙特異性磷酸酶5假基因1(dual-specificity phosphatase 5 pseudogene 1，DUSP5P1)屬于雙特異性磷酸酶5(dual-specificity phosphatase 5，DUSP5)相關(guān)假基因，由1q42染色體編碼[7]，已有相關(guān)報(bào)道lncRNA DUSP5P1在急性髓性白血病細(xì)胞和霍奇金淋巴瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)[7-8]，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，然而，lncRNA DUSP5P1在TNBC的發(fā)病過程中所起的作用目前較少有研究報(bào)道。本研究在體外條件下探討lncRNA DUSP5P1對(duì)TNBC細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 正常人乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞MCF-10A、TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468均購自上海中科院細(xì)胞庫，Trizol、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；Western Blot實(shí)驗(yàn)所用一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、轉(zhuǎn)染試劑、polybrane均購自美國Sigma公司，慢病毒及轉(zhuǎn)染序列設(shè)計(jì)由吉?jiǎng)P基因生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒包裝與感染 取混合包裝質(zhì)粒1.5 μg，shRNA慢病毒質(zhì)粒0.5 μg，Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL混合室溫孵育5 min，取脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 5 μL溶于250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基室溫孵育5 min，將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合后接種于HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48～72 h后收集含有病毒的培養(yǎng)液，此病毒液可用于感染細(xì)胞株，感染24 h后，換上正常培養(yǎng)基加入合適濃度的嘌呤霉素篩選病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞，篩選3代以后，收集細(xì)胞使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)的方法檢測(cè)敲減的效率。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒轉(zhuǎn)染及分組 將TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468及正常人乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞MCF-10A培養(yǎng)于含有2%雙抗、5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將MDA-MB-231細(xì)胞系分為對(duì)照組(negative control，NC)、sh-vector組和sh-DUSP5P1組共3組，分別代表不感染慢病毒、感染空載質(zhì)粒慢病毒和感染sh-DUSP5P1-慢病毒(lentivirus，lenti)。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè) LncRNA DUSP5P1按照操作說明使用Trizol提取細(xì)胞總RNA，使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶將2 μg模板RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在羅氏qRT-PCR儀器中，以GAPDH為內(nèi)參，量化lncRNA DUSP5P1表達(dá)水平。設(shè)計(jì)的引物如下：lncRNA DUSP5P1正向引物5′-GTGCTGAACTAGGGGAGCTG-3′，反向引物5′-AGATGGTGGGTGAACAGGAG-3′；GAPDH上游引物5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物5′-TTGGA GGGATCTCGCTCCT-3′，使用2-△△Ct方法計(jì)算lncRNA DUSP5P1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用NC組、sh-vector組和sh-DUSP5P1組細(xì)胞以每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μL，培養(yǎng)3～5 d后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩5 min使結(jié)晶物溶解，在比色儀上選擇490 nm波長測(cè)定各孔光密度(optical density,OD)值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的NC組、sh-vector組和sh-DUSP5P1組細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞以每皿約200個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種于含10 mL 5% FBS DMEM培養(yǎng)液的皿中，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，PBS清洗后，使用4%多聚甲醛固定15 min，在顯微鏡(低倍鏡)下計(jì)數(shù)大于20個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn) Transwell在24孔板中浸泡1 h；消化細(xì)胞，經(jīng)血清培養(yǎng)基清洗2次，計(jì)數(shù)后配成細(xì)胞懸液，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液；下腔室中加入10%FBS培養(yǎng)基在37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h；取出Transwell用PBS清洗3遍，5%甲醛固定，PBS清洗2遍，加入0.2%結(jié)晶紫室溫染色0.5 h，用棉球拭去表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)10個(gè)視野并照相，記錄，每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。侵襲實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上取300 μL無血清培養(yǎng)基，加入30 μL Matrigel，混勻后加入上室各100 μL；放入37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4～5 h以形成凝膠。

1.2.7 Western Blot實(shí)驗(yàn) 從單層貼壁細(xì)胞中提取總蛋白，每孔50 μg總蛋白上樣，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)膜，5% FBS封閉1 h，分別加入E-cadherin、Vimentin、Snail、GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)，孵育2 h，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，使用Image J灰度分析檢測(cè)條帶，目的蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值比較作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量，每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 TNBC細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞lncRNA DUSP5P1表達(dá)水平比較 LncRNA DUSP5P1在TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468的相對(duì)表達(dá)水平分別為4.17±0.35，2.53±0.35，2.37±0.15，在正常人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中的相對(duì)表達(dá)水平為1.00±0.20。TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468中l(wèi)ncRNA DUSP5P1的表達(dá)水平均明顯高于正常人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A(F=65.10，P<0.05)，圖1。由于MDA-MB-231中l(wèi)ncRNA DUSP5P1表達(dá)相較于4T1和MDA-MB-468均高，并且其表型可同時(shí)用于增殖和遷移實(shí)驗(yàn)，因此我們選擇MDA-MB-231用于慢病毒轉(zhuǎn)染。

2.2 3組細(xì)胞增殖情況比較 由于siRNA-1#敲減效率最高，我們選擇于siRNA-1#用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，3組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48、72 h時(shí)，分別測(cè)定各組細(xì)胞OD490值，與NC組和sh-vector組比較，sh-DUSP5P1組OD490值明顯下降(分別F=33.62，90.72，41.17，77.94；均P<0.05)。3組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，與NC組和sh-vector組比較，sh-DUSP5P1組克隆形成數(shù)明顯減少(F=575.1，P<0.05)。圖2。

2.3 3組細(xì)胞侵襲和遷移情況比較 選取MDA-MB-231細(xì)胞用于細(xì)胞侵襲和遷移功能實(shí)驗(yàn)，在MDA-MB-231細(xì)胞中穩(wěn)定敲減DUSP5P1，敲減DUSP5P1后MDA-MB-231侵襲和遷移能力明顯下降(分別F=933.30，160.20；均P<0.05),圖3。

A：敲減DUSP5P1效率比較；B：MTT實(shí)驗(yàn)OD490值比較；C：克隆形成數(shù)比較與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

與NC組比較，***P<0.001

2.4 在MDA-MB-231細(xì)胞中敲減lncRNA DUSP5P1后對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的影響 采用Western Blot方法，在TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231敲減DUSP5P1后檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的變化。敲減lncRNA DUSP5P1的MDA-MB-231細(xì)胞株sh-DUSP5P1組間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和Snail低于sh-vector組和NC組(分別F=100.11，227.37；均P<0.05)，sh-DUSP5P1組上皮標(biāo)志物E-cadherin高于sh-vector組和NC組(F=6.21，P<0.05)，圖4。

圖4 在MDA-MB-231細(xì)胞中敲減lncRNA DUSP5P1后對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的影響

3 討論

TNBC惡性程度較高容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，由于缺乏激素及人表皮生長因子受體2受體表達(dá)，TNBC對(duì)包括激素、單抗靶向治療在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)化臨床治療效果不佳，TNBC患者往往預(yù)后較差[9]，因此，明確TNBC的發(fā)病機(jī)制對(duì)提高TNBC治療效果顯得尤為重要。

LncRNAs是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)，近期有許多研究報(bào)道lncRNAs在TNBC中異常表達(dá)。Wang等[10]報(bào)道lncRNA RMST抑制TNBC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Zuo等[11]報(bào)道lncRNA MALAT1通過調(diào)控miR-129-5p促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和遷移。Wu等[12]報(bào)道Linc00152通過DNA甲基化途徑抑制乳腺癌1號(hào)基因從而促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。

LncRNA DUSP5P1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA分子，Staege等[7]報(bào)道在包括霍奇金淋巴瘤、造血腫瘤細(xì)胞系、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和尤文肉瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)lncRNA DUSP5P1異常高表達(dá)，其中DUSP5與DUSP5P1相互作用可以影響霍奇金淋巴瘤細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號(hào)通路的激活。本研究檢測(cè)了TNBC細(xì)胞與正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中DUSP5P1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TNBC細(xì)胞較之正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞DUSP5P1表達(dá)水平均高，表明DUSP5P1可能參與了TNBC的發(fā)病，其異常高表達(dá)可能促使乳腺上皮細(xì)胞過度增殖或突變，進(jìn)而發(fā)展成腫瘤。本研究對(duì)3組細(xì)胞系分別進(jìn)行增殖、侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)sh-DUSP5P1組增殖、侵襲及遷移能力均明顯低于對(duì)照組、sh-vector組，提示敲減lncRNA DUSP5P1后TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231增殖、侵襲及遷移能力受到抑制，通常腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，首先要在原發(fā)灶部位侵襲基底膜，然后進(jìn)入血管或淋巴結(jié)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中，腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在乳腺癌的研究中很受關(guān)注[13]，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，上皮細(xì)胞失去極性卻獲得侵入型間充質(zhì)細(xì)胞的特征，從而有利于細(xì)胞的侵襲[14]，進(jìn)一步對(duì)lncRNA DUSP5P1如何影響TNBC侵襲及遷移進(jìn)行機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)敲減lncRNA DUSP5P1的MDA-MB-231細(xì)胞株sh-DUSP5P1組間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和Snail低于sh-vector組，sh-DUSP5P1組上皮標(biāo)志物E-cadherin高于sh-vector組，表明lncRNA DUSP5P1可能通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對(duì)TNBC患者的預(yù)后影響十分重要[15]，這與之前Zhou等[8]報(bào)道DUSP5P1的異常高表達(dá)與急性髓性白血病患者不良預(yù)后有關(guān)類似。近期有研究報(bào)道8號(hào)染色體開放閱讀框76通過結(jié)合DUSP5P1啟動(dòng)子區(qū)域激活ERK信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[16]，與之前Staege等[7]報(bào)道DUSP5P1在霍奇金淋巴瘤中激活ERK信號(hào)通路一致，許多研究報(bào)道癌基因通過激活ERK信號(hào)通路影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17-20]，因此，我們推測(cè)DUSP5P1可能也是通過激活ERK信號(hào)通路影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)TNBC的侵襲和轉(zhuǎn)移，具體機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示lncRNA DUSP5P1在TNBC細(xì)胞中高表達(dá)，沉默DUSP5P1表達(dá)可抑制TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231增殖、侵襲及遷移。進(jìn)一步對(duì)侵襲和遷移進(jìn)行機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DUSP5P1可能通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移。LncRNA DUSP5P1有望成為TNBC治療的新靶點(diǎn)，當(dāng)然，本研究尚有一些不足，缺少體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究數(shù)據(jù)，涉及l(fā)ncRNA DUSP5P1與ERK信號(hào)通路的分子機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。