魏前燈，鄭文波，孫 凱

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)多發(fā)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)城市和農(nóng)村的發(fā)病率分別為常見(jiàn)惡性腫瘤的第4和第5位，而隨著我國(guó)生活水平的日益提高和飲食習(xí)慣的相應(yīng)轉(zhuǎn)變，其總體發(fā)病率逐年上升[1]。以廣州地區(qū)為例，2010年—2014年期間，在廣州共登記了14 618例結(jié)直腸癌病例，粗發(fā)病率為35.56/100 000，粗發(fā)病率從2010年(32.88/100 000)到2014年(39.36/100 000)增長(zhǎng)了19.70%，平均年變化率為4.33%[2]。但目前我國(guó)結(jié)直腸癌臨床診治效果仍不盡人意，5年生存率徘徊不前，提高結(jié)直腸癌的綜合治療效果具有重要的科學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義，而國(guó)人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分子特征的深入研究將為加強(qiáng)和促進(jìn)我國(guó)結(jié)直腸癌防治工作提供必要的理論基礎(chǔ)[3-4]。

近年研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)在mRNA轉(zhuǎn)錄后基因沉默中發(fā)揮著重要作用[5]。MiRNA是存在于各種生物體內(nèi)的由19～22個(gè)核糖核苷酸組成的一類(lèi)新型小分子RNA。MiRNA來(lái)自于內(nèi)源性基因組DNA的非編碼區(qū)的直接轉(zhuǎn)錄，首先在核內(nèi)生成miRNA前體，繼而在轉(zhuǎn)運(yùn)體的運(yùn)載下由細(xì)胞核移出至胞漿，經(jīng)Dicer酶切割成熟并與Argonaute(AGO)蛋白組裝成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，并與靶mRNA3′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)互補(bǔ)結(jié)合，從而切割降解目的mRNA或僅抑制靶mRNA的進(jìn)一步翻譯，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，其究竟執(zhí)行何種功能取決于AGO蛋白亞類(lèi)是否具有內(nèi)切核酸酶活性及miRNA與mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度，這一現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制[6]。

既往研究表明，miR-92a在結(jié)直腸癌患者中表達(dá)上調(diào)[7]，但是其表達(dá)異常在結(jié)直腸腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及對(duì)預(yù)后的影響尚知之甚少。本研究回顧性分析miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征、生存狀況和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年10月—2014年6月于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院接受手術(shù)治療的124例結(jié)直腸癌患者的臨床資料，其中男71例，女53例，年齡23～89歲。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌、術(shù)前均未接受放化療、原發(fā)腫瘤局部行根治性手術(shù)治療、術(shù)后完成3年隨訪(fǎng)調(diào)查、臨床及隨訪(fǎng)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):心肝腎肺器質(zhì)性功能障礙者、腦血管疾病者、腸外腫瘤者、自身免疫功能缺陷者、血液系統(tǒng)疾病者、精神障礙者、妊娠或哺乳期女性、臨床及隨訪(fǎng)資料不完整者。所有病例均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌，術(shù)前均未接受放療和化療，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法 使用原位雜交法檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤組織中miR-92a表達(dá)水平?；颊叩哪[瘤組織石蠟包埋后切片，厚度控制為3 μm，其用地高辛標(biāo)記的探針(日本TaKaRa公司)原位雜交后染色。MiR-92a的地高辛標(biāo)記探針的序列如下：5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′。讀片和圖像采集使用Nikon 80i顯微鏡(日本尼康公司)，同時(shí)使用Nikon NIS-Elements F2.3軟件(日本尼康公司)進(jìn)行分析。兩名研究人員獨(dú)立鏡檢，并使用基于DAB法染色程度的視覺(jué)分級(jí)系統(tǒng)定量miR-92a表達(dá)。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 采用半定量法，應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡，高倍鏡下(10×10)隨機(jī)取5個(gè)不同的視野。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率并進(jìn)行積分(0分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1分,1%～25%；2分,26%～50%；3分,51%～75%；4分，>75%),同時(shí)觀(guān)察染色強(qiáng)度(0分，無(wú)染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色)。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率積分與染色強(qiáng)度積分的乘積來(lái)定義腫瘤組織中miR-92a的相對(duì)表達(dá)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 選用SPSS 20.0軟件；應(yīng)用卡方檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析miR-92a表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan-Meier方法分析結(jié)直腸癌患者術(shù)后3年生存率及生存時(shí)間；應(yīng)用單因素及多因素Cox回歸模型分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-92a表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 使用原位雜交法分析患者的miR-92a表達(dá)(圖1)；取中位表達(dá)水平作為閾值將124例患者分為miR-92a高表達(dá)組(乘積≥7)和miR-92a低表達(dá)組(乘積<7)，各62例。結(jié)直腸腺癌患者miR-92a的表達(dá)與性別(P=0.204)、年齡(P=0.590)、BMI指數(shù)(P=0.145)、腫瘤大小(P=0.043)和腫瘤部位(P=0.369)無(wú)明顯相關(guān)性；而與結(jié)直腸腺癌分化程度(P=0.015)、T分期(P=0.031)、N分期(P=0.030)、M分期(P=0.011)和AJCC臨床分期(P=0.047)存在顯著相關(guān)性(表1)。

圖1 結(jié)直腸癌組織中的miR-92a的表達(dá)(DAB法顯色，×100倍)

表1 結(jié)直腸癌患者臨床病理特點(diǎn)與miR-92a表達(dá)

2.2 MiR-92a表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存的關(guān)系 不同miR-92a表達(dá)組生存曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。高表達(dá)組和低表達(dá)組術(shù)后3年累積生存率分別為66.1%和91.9%，中位生存時(shí)間分別為29.350(95%CI：26.627～32.074)個(gè)月和34.939(95%CI：33.078～36.799)個(gè)月，miR-92a高表達(dá)組累積生存率明顯低于miR-92a低表達(dá)組，兩者術(shù)后生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.006,P=0.001)。

圖2 不同miR-92a表達(dá)組生存曲線(xiàn)

2.3 MiR-92a表達(dá)與直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 應(yīng)用單因素Cox回歸模型分析顯示，不良生存率與腫瘤大小(HR=2.293；95%CI=1.052～4.995；P=0.037)、分化程度(HR=2.762；95%CI=1.197～6.374；P=0.017)、T分期(HR=6.074；95%CI=0.822～44.859；P=0.044)、N分期(HR=7.985；95%CI=2.747～23.206；P=0.001)、M分期(HR=4.938；95%CI=2.227～10.952；P=0.001)、AJCC分期(HR=5.863；95%CI=2.207～15.573；P=0.001)、及miR-92a表達(dá)(HR=4.749；95%CI=1.790～12.602；P=0.002)顯著相關(guān)。通過(guò)調(diào)整，將腫瘤大小、腫瘤分化、AJCC分期和miR-92a表達(dá)納入多因素分析[由于已知結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度(T分期)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M分期)與AJCC分期相互影響，所以從多變量生存分析中被預(yù)先排除]。結(jié)果顯示AJCC分期(HR=6.983；95%CI=2.074～23.509；P=0.002)和miR-92a表達(dá)(HR=3.165；95%CI=1.144～8.756；P=0.026)是不良總生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(表2)。

表2 結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間的單因素及多因素分析

3 討論

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌是位于發(fā)病率第三的常見(jiàn)惡性腫瘤[9]。在我國(guó)，高發(fā)病率和高死亡率是結(jié)直腸癌主要特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民身體健康[10]。根治性、規(guī)范化外科手術(shù)和新興化療藥物盡管已經(jīng)使結(jié)直腸癌的近期療效得到了顯著的改善，但仍無(wú)法顯著提高患者的5年生存率[4]。因此，探尋影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素并對(duì)這些因素進(jìn)行積極干預(yù)具有重要的理論和實(shí)踐意義，理論上可以進(jìn)一步豐富結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，實(shí)踐中可以指導(dǎo)臨床針對(duì)結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)防、治療和預(yù)后提供新的策略和思路。

MiRNA在mRNA轉(zhuǎn)錄后基因沉默中發(fā)揮著重要作用,其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。既往研究表明，miR-92a在結(jié)直腸癌患者中表達(dá)上調(diào)[13-15]。在本研究中，我們對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤組織芯片進(jìn)行miR-92a原位雜交，取中位表達(dá)水平作為閾值將患者分為miR-92a高表達(dá)組和miR-92a低表達(dá)組。發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者miR-92a的表達(dá)與性別、年齡、BMI指數(shù)、腫瘤大小和腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性，而與結(jié)直腸癌分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和AJCC臨床分期存在顯著相關(guān)性。這提示結(jié)直腸腫瘤組織中高表達(dá)miR-92a可能與患者不良預(yù)后有關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們對(duì)2組患者進(jìn)行了Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果提示高表達(dá)組患者的累積生存率明顯低于低表達(dá)組。單因素Cox回歸分析中，不良生存率與腫瘤大小、分化程度、T分期、N分期、M分期、AJCC分期和miR-92a表達(dá)相關(guān)。Cox回歸分析結(jié)果提示miR-92a可能參與了結(jié)直腸癌的病情進(jìn)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程，與國(guó)外研究結(jié)論一致[15-16]。因此，在臨床工作中可通過(guò)對(duì)miR-92a表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步有效評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，為臨床治療方案的制訂提供參考信息?；趩巫兞可娣治龅慕Y(jié)果進(jìn)行多變量生存分析，AJCC分期和miR-92a表達(dá)被認(rèn)定為是不良總生存時(shí)間的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素，這為miR-92a可能作為未來(lái)結(jié)直腸癌治療的有效分子標(biāo)志物提供了有力的證據(jù)。臨床上可通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織miR-92a表達(dá)情況，從而對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估，miR-92a表達(dá)越高，患者遠(yuǎn)期預(yù)后可能越差。

本研究揭示了miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)模式，并提示了其作為診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值。MiR-92a在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。