劉 奎，葛 壯，徐英德，劉 磊，葉 超，李 明，趙 搏，梁愛珍，張彬?，汪景寬

不同耕作方式下黑土微生物群落對(duì)干濕交替的響應(yīng)*

劉 奎1，葛 壯1，徐英德1，劉 磊1，葉 超1，李 明1，趙 搏1，梁愛珍2，張彬1?，汪景寬1

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110866；2. 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)春 130102；3. 南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院，南京 210044）

以吉林德惠市黑土長(zhǎng)期田間定位實(shí)驗(yàn)地土壤為研究對(duì)象，通過室內(nèi)模擬培養(yǎng)，采用高通量測(cè)序方法（16S rRNA）研究免耕和壟作土壤微生物群落對(duì)不同頻率和強(qiáng)度的干濕交替處理的響應(yīng)。結(jié)果表明：干濕交替顯著降低免耕土壤中微生物群落的多樣性，且頻率越高干旱強(qiáng)度越大多樣性降低越顯著；但干濕交替對(duì)壟作土壤的微生物多樣性影響不顯著。與對(duì)照相比，干濕交替顯著增加免耕土壤中浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對(duì)豐度，顯著降低免耕和壟作土壤中Saccharibacteria菌門和Parcubacteria菌門的相對(duì)豐度。無論是免耕還是壟作條件下，干濕交替頻率的不同導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著差異，而干濕交替強(qiáng)度的不同對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。研究結(jié)果為預(yù)測(cè)干旱氣候?qū)谕辽鷳B(tài)功能的影響提供了理論基礎(chǔ)。

耕作方式；干濕交替；土壤微生物群落；黑土；高通量測(cè)序

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤有機(jī)質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化、土壤養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質(zhì)量和肥力的一個(gè)重要指標(biāo)[2]。影響土壤微生物群落組成發(fā)生變化的因素很多，如耕作方式、水分管理和施肥措施等。其中，干濕交替是土壤微生物群落經(jīng)常面臨的環(huán)境變化。近年來，由于全球氣候變化導(dǎo)致干旱和降水的模式會(huì)不斷發(fā)生改變[3]，氣候變化模型預(yù)測(cè)未來土壤干濕交替的頻率和強(qiáng)度將更大[4]，因此探討干濕交替對(duì)土壤微生物群落的影響具有重要意義。目前關(guān)于干濕交替對(duì)土壤微生物群落的影響已有一些報(bào)道，例如包麗君和賈仲君[5]研究了干濕交替對(duì)水稻土中古菌群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)反復(fù)的干濕交替并未顯著影響水稻土古菌的主要類群組成，但古菌的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)豐度發(fā)生了一定程度的變化；王苑等[6]研究發(fā)現(xiàn)多次干濕交替顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，大大降低土壤真菌與細(xì)菌的比例，使細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)種群。已有研究大部分僅關(guān)注某些特定土壤微生物類群對(duì)干濕交替的響應(yīng)，也有一部分研究采用磷脂脂肪酸法（PLFA）或變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）方法考察干濕交替對(duì)整個(gè)土壤微生物群落的影響，然而這些方法在對(duì)數(shù)量少但具有重要功能的土壤微生物類群的檢測(cè)上有較大的局限性，極有可能低估土壤微生物的物種組成并高估其豐度[7]。而高通量測(cè)序技術(shù)則能在整體微生物群落水平分析微生物遺傳多樣性，并能較為客觀地反映其中低豐度的重要功能微生物。

東北黑土區(qū)是我國(guó)的糧食主產(chǎn)區(qū)，然而長(zhǎng)期的傳統(tǒng)耕作導(dǎo)致農(nóng)田黑土退化嚴(yán)重[8-10]。由于傳統(tǒng)耕作方式頻繁地耕翻，又加之缺少有機(jī)物料歸還，使土壤微生物的群落多樣性和數(shù)量顯著下降[11-12]。近年來免耕秸稈還田作為一項(xiàng)提高土壤有機(jī)質(zhì)含量、改善土壤結(jié)構(gòu)和生物特性的有力措施受到了廣泛關(guān)注。長(zhǎng)期不同耕作方式使土壤的水氣熱和養(yǎng)分狀況等理化性質(zhì)發(fā)生變化[13-16]，從而對(duì)土壤微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)有著顯著的影響[17-19]。路怡青等[20]對(duì)免耕和常規(guī)耕作的土壤微生物群落的數(shù)量進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)免耕土壤微生物群落的數(shù)量顯著大于常規(guī)耕作。Zhang等[21]研究了傳統(tǒng)耕作與免耕對(duì)黑土微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)免耕秸稈還田顯著增加了土壤微生物群落中真菌與細(xì)菌比例。然而目前關(guān)于不同耕作方式下農(nóng)田土壤微生物群落對(duì)干濕交替響應(yīng)的研究還鮮見報(bào)道。本文通過室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，利用高通量測(cè)序的方法，研究免耕和壟作土壤在經(jīng)過不同頻率和強(qiáng)度的干濕交替后，其土壤微生物群落的多樣性、豐度和結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，對(duì)預(yù)測(cè)干旱對(duì)不同耕作方式土壤功能的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)土壤為黑土，取自吉林省德惠市米沙子鄉(xiāng)黑土農(nóng)田試驗(yàn)基地（44°12′N，25°33′E）長(zhǎng)期定位試驗(yàn)樣地。該區(qū)屬于中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫4.4 ℃，年均降雨量520 mm。長(zhǎng)期試驗(yàn)開始于2001年秋，布置不同的耕作與作物輪作處理，每種處理包含3個(gè)重復(fù)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。本研究選取其中的免耕和壟作處理，種植作物均為玉米（L.）連作。免耕對(duì)土壤的擾動(dòng)小，主要是播種和施肥時(shí)免耕播種機(jī)切刀開溝的擾動(dòng)；壟作除播種、中耕和鋤草外，其他時(shí)期不進(jìn)行土壤擾動(dòng)，中耕時(shí)在作物種植行頂端起壟。兩種耕作方式下秸稈全部還田，每年在播種時(shí)施用N 100 kg·hm–2、P 45.5 kg·hm–2、K 78 kg·hm–2，在玉米第6葉時(shí)期追施N 50 kg·hm–2[22]。

土壤樣品采集于2014年春季播種前，用土鉆采集0～10 cm 表層土壤。每個(gè)小區(qū)散點(diǎn)取樣后混合成為一個(gè)樣品。新鮮土樣裝入冷藏箱帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除可見根系和石塊并混勻后過4 mm篩，在冰箱中保存。

1.2 培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)五個(gè)不同頻率和強(qiáng)度的干濕交替處理：（1）對(duì)照處理（CK），土壤含水量保持在田間持水量的 60%；（2）1次中等干旱—澆水循環(huán)（MDW1），使土壤含水量從田間持水量的 60%逐漸下降至萎焉點(diǎn)的120%并保持該水平12 d后澆水，使土壤含水量恢復(fù)至田間持水量的60%并保持2 d；（3）1次極干旱—澆水循環(huán)（VDW1），使土壤含水量從田間持水量的60%逐漸下降至萎焉點(diǎn)的80%并保持在該水平，12 d后進(jìn)行澆水使土壤含水量恢復(fù)至田間持水量的60%并保持2 d；（4）3次中等干旱—澆水循環(huán)（MDW3），使土壤含水量從田間持水量的60%逐漸下降至萎焉點(diǎn)的120%并保持在該水平，12 d后進(jìn)行澆水使土壤含水量恢復(fù)至田間持水量的60%并保持2 d，設(shè)置3次循環(huán)，每次周期為14 d；（5）3 次極干旱—澆水循環(huán)（VDW3），使土壤含水量從田間持水量的60%逐漸下降至萎焉點(diǎn)的80%并保持在該水平，12 d后進(jìn)行澆水使土壤含水量恢復(fù)至田間持水量的60%并保持2 d，設(shè)置3次循環(huán)，每次周期為14 d。其中干旱—澆水循環(huán)的周期是根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置的，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土壤含水量從田間持水量的60%逐漸下降至不同目標(biāo)含水量所需的最長(zhǎng)時(shí)間為12 d。

將低溫保存的土樣裝入底部用封口膜擋住的 PVC 管（高5 cm、直徑4.8 cm），使得管中的土壤容重達(dá)到田間對(duì)應(yīng)耕作處理下的土壤容重。不同耕作方式下土壤的裝入量（按干土重計(jì)）為免耕115.75 g、壟作113.04 g。兩種耕作處理一共裝30個(gè)PVC管（2種耕作×5種干濕交替×3個(gè)重復(fù)）。用注射器向裝好的 PVC 管中均勻地加入蒸餾水，使得土壤含水量達(dá)到田間持水量的60%，然后將PVC管豎直放入250 mL的培養(yǎng)瓶中，用封口膜封口以減少水分蒸發(fā)而同時(shí)不造成厭氧條件。然后放入培養(yǎng)箱中，在20 °C條件下預(yù)培養(yǎng)2周，然后按照上述干濕交替試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行。土樣的逐漸變干是通過在培養(yǎng)瓶中放入裝有硅膠干燥劑（50 g）的小燒杯來實(shí)現(xiàn)的。在樣品變干的過程中不定期稱量PVC管以了解水分的損失情況，同時(shí)更換硅膠干燥劑，當(dāng)土壤含水量下降至目標(biāo)含水量后將小燒杯移除。對(duì)土樣進(jìn)行澆水是通過用注射劑向土壤表面均勻加入蒸餾水來實(shí)現(xiàn)的，通過稱量PVC管確定水分加入量。當(dāng)干濕交替實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即采集土壤進(jìn)行土壤理化性質(zhì)和微生物群落分析。土壤有效磷采用0.5 mol·L–1NaHCO3溶液浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定，土壤速效鉀采用1 mol·L–1NH4OAc浸提（1︰10土液比）、火焰光度法（型號(hào)AP1200）測(cè)定[23]。土壤pH使用復(fù)合電極測(cè)定，土水比為1︰5。土壤全碳和全氮含量采用元素分析儀測(cè)定（Elementar CN Analyzer，德國(guó)）。

1.3 土壤微生物群落分析

土壤DNA的提取采用Power Soil@DNA Isolation Kit試劑盒（Mo Bio公司，美國(guó)），采用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量，然后于–20℃低溫保存。

對(duì)細(xì)菌16s rRNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物是338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGC AG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGG TWTCTAAT- 3’）。PCR反應(yīng)體系（25 μL）包括2.5 μL 10×Pyrobest Buffer，2 μL dNTPs（5 mmol·L–1），1 μL 338F/806R（10 μmol·L–1），0.4 U Pyrobest DNA聚合酶，15 ng DNA模板。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

用2%瓊脂糖凝膠提取擴(kuò)增子，用試劑盒（Axygen Biosciences，美國(guó)）對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行純化后上Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。首先使用QIIME軟件對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制，和過濾，移除低質(zhì)量的原始序列，用過濾后的序列進(jìn)行后續(xù)分析。對(duì)每個(gè)樣品的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用UCLUST軟件根據(jù)序列相似性進(jìn)行聚類，選擇97%作為相似性閾值，得到可操作分類單元表（OTU）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用單因素方差分析（ANOVA）和圖基檢驗(yàn)（Tukey’s HSD）考察干濕交替對(duì)不同土壤理化性質(zhì)、多樣性指數(shù)及相對(duì)豐度的影響。應(yīng)用R軟件（version 3.4.4）進(jìn)行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）。用OringinPro 2015和R軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 干濕交替對(duì)免耕和壟作土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性的影響

免耕和壟作土壤的pH、全氮、全碳和有效磷變化趨勢(shì)一致，均不受干濕交替處理的影響；而速效鉀隨著干濕交替的頻率和強(qiáng)度的加強(qiáng)呈顯著降低趨勢(shì)（表1）。與對(duì)照處理相比，不同頻率和強(qiáng)度的干濕交替顯著降低了免耕土壤微生物的Chao1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)，尤其是在3次極干旱—澆水循環(huán)條件下降低最顯著（表2）。干濕交替對(duì)壟作土壤微生物Chao1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)的影響相對(duì)較小，僅3次極干旱—澆水循環(huán)處理土壤Chao1指數(shù)顯著低于對(duì)照。兩種耕作處理相比，壟作土壤中的兩種微生物多樣性指數(shù)均顯著高于免耕土壤（表2）。

2.2 干濕交替后不同土壤微生物群落的相對(duì)豐度

兩種耕作方式的土壤中均檢測(cè)到變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Saccharibacteria、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycete）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和Parcubacteria等11個(gè)菌門，將相對(duì)豐度低于1%的微生物合并為Other。

免耕土壤干濕交替處理后微生物在門水平上的相對(duì)豐度如圖1a所示。其中變形菌門（Proteobacteria）在土壤各處理中是極其優(yōu)勢(shì)的門類，其占比最大（47.85%～54.1%），相對(duì)豐度在1次極干旱—澆水處理下最高，而在1次中等干旱—澆水處理下最低。與對(duì)照相比，干濕交替后免耕土壤中浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對(duì)豐度顯著增加（<0.05），并且干濕交替的頻率和強(qiáng)度越大，其相對(duì)豐度越高，尤其在3次極干旱—澆水處理中的相對(duì)豐度增幅分別為240.0%和176.4%。而免耕土壤中的Saccharibacteria菌門和Parcubacteria菌門的相對(duì)豐度與對(duì)照相比，隨著干濕交替強(qiáng)度和頻率的增大而降低，兩類微生物相對(duì)豐度的降幅在3次極干旱—澆水處理中達(dá)到55.9%（Saccharibacteria）和89.3%（Parcubacteria）。免耕土壤中厚壁菌門（Firmicutes）及其他菌門的相對(duì)豐度變化不明顯。

表1 不同干濕交替處理對(duì)免耕和壟作土壤理化性質(zhì)的影響

注：CK，對(duì)照；MDW1，1次中等干旱—澆水循環(huán)；VDW1，1次極干旱—澆水循環(huán)；MDW3，3次中等干旱—澆水循環(huán)；VDW3，3次極干旱—澆水循環(huán)。同列不同小寫字母表示該耕作方式向下各處理差異顯著（<0.05），平均值后面的數(shù)字為標(biāo)準(zhǔn)差。下同。Note：CK，Control；MDW1，one round of moderate dry-wet alternation；VDW1，one round of extreme dry-wet alternation；M DW3，three rounds of moderate dry-wet alternation；VDW3，three rounds of extreme dry-wet alternation. Different lowercase letters in the same row indicate significant difference between treatments（<0.05），means ± standard deviations. The same below.

表2 不同干濕交替處理對(duì)免耕和壟作土壤微生物多樣性的影響

壟作土壤干濕交替處理后微生物在門水平上的相對(duì)豐度如圖1b所示。壟作土壤中變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度顯著低于免耕土壤（<0.05），而放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度顯著高于免耕土壤（<0.05）。變形菌門（Proteobacteria）在壟作土壤中的相對(duì)豐度也最大，而且其相對(duì)豐度在對(duì)照處理時(shí)最低，在3次中等干旱—澆水處理中最高。干濕交替后壟作土壤中Saccharibacteria門和Parcubacteria門的相對(duì)豐度顯著下降，而芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度顯著提高。厚壁菌門（Firmicutes）及其他菌門相對(duì)豐度的變化不明顯。

免耕土壤中占比最大的菌屬是鞘氨醇單胞菌屬（），占比達(dá)18%～30%（圖2a）。與對(duì)照相比，免耕土壤中乳桿菌屬（）、根霉菌屬（）、硝基菌屬（）和Groundwatermetagenome菌屬隨著干濕交替的頻率和強(qiáng)度的增加而降低。芽單胞菌屬（）等其他的菌屬變化不顯著。壟作土壤的鞘氨醇單胞菌屬（）、乳桿菌屬（）、假橄欖屬（）、根霉屬（）和顆粒菌屬（）的相對(duì)豐度低于免耕土壤，而壟作土壤的未分類（）和其他（Other）的菌屬的相對(duì)豐度高于免耕土壤（圖2b）。鞘脂單胞菌屬（）在壟作土壤中相對(duì)豐度占比最高（14%～21%）。與對(duì)照相比，壟作土壤中鞘氨醇單胞菌屬（）和Groundwater metagenome菌屬隨著干濕交替的頻率和強(qiáng)度的增強(qiáng)其相對(duì)豐度降低，而芽單胞菌屬（）隨著干濕交替的頻率和強(qiáng)度的增強(qiáng)其相對(duì)豐度增加。根霉菌屬（）等其他菌屬變化不顯著。

圖1 不同干濕交替處理后免耕（a）和壟作（b）土壤微生物在門水平上的相對(duì)豐度

圖2 不同干濕交替處理后免耕（a）和壟作（b）土壤微生物在屬水平上的相對(duì)豐度

2.3 干濕交替后不同土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

對(duì)兩種耕作方式下的土壤微生物群落進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)第一主成分的變異主要是由耕作方式不同導(dǎo)致的。無論何種干濕交替處理，免耕和壟作土壤微生物群落總是分布在主成分分析圖的左右兩側(cè)，說明不同耕作方式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異極顯著，這與我們前期的研究結(jié)果一致[21]。為深入考察不同干濕交替處理對(duì)每種耕作方式土壤微生物群落的影響，將兩種耕作方式的主成分分析圖獨(dú)立呈現(xiàn)。

由圖3可知，免耕土壤主成分分析結(jié)果顯示其第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率分別為48.8%和13.9%，壟作土壤PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為36.6%和18.6%。兩種耕作方式下的土壤微生物群落對(duì)不同干濕交替處理的響應(yīng)規(guī)律較為一致。與對(duì)照相比，干濕交替顯著改變了兩種土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)微生物群落的變化受干濕交替的頻率影響較大，而受干濕交替強(qiáng)度的影響較小。1次干旱—澆水循環(huán)和3次干旱—澆水循環(huán)處理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，然而在相同頻率澆水循環(huán)下，不同強(qiáng)度的干旱處理對(duì)兩種土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成沒有顯著影響。

圖3 干濕交替后免耕（a）和壟作（b）土壤微生物群落的主成分分析

2.4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

選取土壤的有效磷、速效鉀、全氮、全碳和pH作為環(huán)境因子，對(duì)免耕和壟作土壤的微生物11個(gè)門類做冗余分析。由圖4a可知，5個(gè)理化因子解釋了20.1%的總特征值，說明理化因子對(duì)免耕土壤的微生物的含量和分布有一定的影響。其中，速效鉀是影響土壤微生物分布和數(shù)量的主要環(huán)境因素，對(duì)照處理（CK）和1次中等干旱—澆水循環(huán)（MDW1）的土壤微生物分布與速效鉀呈正相關(guān)，與pH和全氮呈負(fù)相關(guān)；1次極干旱—澆水循環(huán)（VDW1）處理土壤微生物分布與有效磷呈正相關(guān)，與全碳呈負(fù)相關(guān)；3次中等干旱—澆水循環(huán)（MDW3）處理和3次極干旱—澆水循環(huán)（VDW3）處理的土壤微生物分布與pH和全氮呈正相關(guān)，與有效磷呈負(fù)相關(guān)。圖4b表示5個(gè)理化因子對(duì)壟作土壤微生物含量和分布的影響，其解釋了51.5%的總特征值，對(duì)壟作的微生物有一定的影響。進(jìn)而說明，對(duì)照處理（CK）和1次中等干旱—澆水循環(huán)（MDW1）與速效鉀呈正相關(guān)；3次中等干旱—澆水循環(huán)（MDW3）處理與有效磷、全氮和全碳呈正相關(guān)，與pH呈負(fù)相關(guān)。理化因子對(duì)壟作土壤的1次極干旱—澆水循環(huán)（VDW1）處理和3次極干旱—澆水循環(huán)（VDW3）處理的微生物分布影響較小。

3 討 論

3.1 干濕交替對(duì)土壤微生物群落的影響

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成特性在土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分循環(huán)過程中發(fā)揮著重要意義[24]，而水分狀況（如干濕交替）是影響土壤微生物群落數(shù)量、結(jié)構(gòu)和多樣性的重要作用因子[25-26]。本研究表明，干濕交替顯著降低了免耕土壤中微生物群落的多樣性，并且對(duì)免耕和壟作土壤微生物群落的相對(duì)豐度有著不同程度的影響。有研究表明，在干濕交替情況下土壤微生物量的降低主要表現(xiàn)在干旱后期，是由于干旱條件下有一部分微生物凋亡造成的[27]。在土壤中的某些微生物群落因?yàn)楦珊档臈l件就表現(xiàn)出其群落的消失，在土壤濕潤(rùn)后，其群落也不會(huì)再次出現(xiàn)。另一方面，干濕交替導(dǎo)致土壤膨脹收縮，破壞了土壤中的菌絲體，從而切斷了土壤與植物殘?bào)w之間搭建起“養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)臉蛄骸?，阻礙了微生物對(duì)土壤的碳氮等養(yǎng)分的截獲[28-29]，使得微生物可利用的養(yǎng)分減少，直接影響了微生物的自身生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致微生物的生物量減少、多樣性降低。

圖4 免耕（a）和壟作（b）土壤理化性質(zhì)與土壤微生物門類冗余分析

3.2 耕作方式對(duì)土壤微生物多樣性和結(jié)構(gòu)的影響

有研究表明，耕作方式影響著土壤有機(jī)碳、土壤微生物量和酶活性[31-33]，而土壤有機(jī)碳、土壤微生物量和酶活性影響著土壤微生物的群落組成。在本研究中壟作的土壤微生物量和微生物的多樣性顯著高于免耕土壤，這與陳娟等[34]研究相一致。其原因可能是壟作改變了田間地形，獨(dú)特的壟溝結(jié)構(gòu)，改善了土壤水、熱、氣和光等條件，為微生物的繁衍生息創(chuàng)造了良好的環(huán)境，此外有研究表明，酸性的土壤環(huán)境會(huì)降低土壤微生物多樣性，抑制土壤微生物酶活性[35]，并且壟作使土壤中的團(tuán)聚體被破壞，釋放出土壤中的生物碳和有機(jī)物質(zhì)，有利于微生物的生長(zhǎng)和繁殖。Xue等[36]研究也表明，壟作能為土壤微生物提供更多的有機(jī)物質(zhì)，使微生物的數(shù)量增加。壟作提高了土壤微生物的多樣性和豐富度，在一定程度上能夠增加有機(jī)質(zhì)的分解，有利于作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。在本實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)，免耕土壤的3次中等干旱—澆水循環(huán)處理下微生物的豐富度顯著高于1次中等干旱—澆水循環(huán)和1次極干旱—澆水循環(huán)，這可能是土壤干旱時(shí)微生物細(xì)胞萎蔫，細(xì)胞中能量轉(zhuǎn)移受阻[37-38]，養(yǎng)分吸收減少，微生物生長(zhǎng)受阻。土壤中大量凋亡的微生物變成有機(jī)物質(zhì)，再加之多次的干濕交替后土壤中團(tuán)聚體裂解釋放出有機(jī)質(zhì)[6]，在濕潤(rùn)后，微生物有了更好的生境，所以微生物的豐富度表現(xiàn)增加，而多樣性表現(xiàn)降低。而壟作的土壤并沒有出現(xiàn)這種狀況，這可能是壟作土壤在耕作的時(shí)候已經(jīng)破壞了土壤的團(tuán)聚體，釋放出有機(jī)質(zhì)，在干濕交替實(shí)驗(yàn)后，也就沒有微生物突增的基礎(chǔ)，這也與上文關(guān)于壟作土壤的推測(cè)一致。

干濕交替的強(qiáng)度對(duì)兩種耕作方式的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響均不大，而干濕交替的頻率顯著改變了免耕和壟作土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。由此可見，兩種耕作方式下土壤微生物群落對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)是一致的。由RDA分析顯示，免耕和壟作土壤微生物門類對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)不相同，尤其在面對(duì)3次極干旱—澆水循環(huán)處理時(shí)，表現(xiàn)尤為明顯。例如壟作和免耕土壤的對(duì)照（CK）處理對(duì)速效鉀表現(xiàn)出相關(guān)性，但是相關(guān)程度不同，在3次極干旱—澆水循環(huán)的環(huán)境脅迫下，免耕土壤微生物門類與pH和全氮表現(xiàn)出相關(guān)，但是壟作土壤微生物與5個(gè)環(huán)境因子均表現(xiàn)出不相關(guān)。這就說明，兩種土壤的微生物門類分布和數(shù)量存在差異。由相對(duì)豐度可以看出，免耕的土壤微生物群落在面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)，各個(gè)菌門之間的比例變化不大，菌屬變化較大，而壟作的變化則與之相反，如Parcubacteria菌門變化了96.76%，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）變化了60.84%，在屬水平上，壟作土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化小于免耕，例如免耕的鞘氨醇單胞菌屬（）和芽單胞菌屬（）變化了61.11%和68.71%，而壟作變化了50.01%和23.51%。在門水平上，免耕土壤的微生物的結(jié)構(gòu)變化要小于壟作土壤的微生物，這有可能是免耕保護(hù)了土壤的團(tuán)聚體，團(tuán)聚體為土壤中微生物提供了庇護(hù)，保證了其微生物各個(gè)群落之間的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[39]。在環(huán)境脅迫解除后，由團(tuán)聚體庇護(hù)的群落開始繁殖，保證了其群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。這在某種意義上說明，免耕對(duì)微生物的群落起到了保護(hù)作用，而在屬水平上，這種保護(hù)作用并沒有起效，更多反映出的是壟作提供了良好的土壤條件，減小菌屬對(duì)環(huán)境變化時(shí)的沖擊力。但在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)作物的影響，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

4 結(jié) 論

干濕交替的頻率越高干旱強(qiáng)度越大，免耕土壤微生物的多樣性越低；而干濕交替對(duì)壟作土壤微生物多樣性的影響不顯著。兩種耕作方式下，干濕交替頻率的不同導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，而干濕交替的強(qiáng)度對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

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Responses of Soil Microbial Community to Drying-Wetting Alternation Relative to Tillage Mode

LIU Kui1, GE Zhuang1, XU Yingde1, LIU Lei1, YE Chao1, LI Ming1, ZHAO Bo1, LIANG Aizhen2, ZHANG Bin1?, WANG Jingkuan1

(1.College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2.Northeast Institute of Geography and Agricultural Ecology, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130102, China; 3. School of Applied Meteorology, Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China)

In this study, effects of dry-wet alternation on diversity, abundance and structure of the soil microbial community in the black soil of a long-term stationary field experiment in Dehui of Jilin on tillage modes, no-tillage or ridge tillage, were investigated. So far few reports were detected in the literature about responses of the soil microbial community in the soil subjected to drying-wetting alternation under no-tillage or ridge tillage. In this paper, soil samples were collected for analysis by means of high-throughput sequencing in laboratory. This research was expected to be of great significance to prediction of impacts of drought on soil functions under different tillage practices.No-tillage and ridge tillage plots in the field experiment had been cultivated with maize (L.) for 13 years. Soil samples were collected with a T sampler, ground to pass a 4-mm sieve, and then packed separately into PVC pipes with a sealing film at the bottom of each pipe to make the soil in the pipe the same in bulk density as that in the plot under no-tillage or ridge tillage. The amount of soil packed into the pipe for no-tillage was 115.75 g and for ridge tillage, 113.04 g. Five dry-wet treatments different in frequency and intensity were designed and implemented: (1) CK as control; (2) MDW1, one round of moderate dry-wet alternation; (3) VDW1, one round of very dry-wet alternation; (4) MDW3, three rounds of moderate dry-wet alternation; and (5) VDW3, three rounds of very dry-wet alternation. Soil microbial communities were investigated by means of Illumina Miseq sequencing. Soil available phosphorus and available potassium were determined with conventional analysis methods. Soil pH was determined with a composite electrode. And soil water ratio was set as 1: 5. For measuring carbon and nitrogen, a part of each treated soil sample was ground to pass a 0.85 mm sieve. Total carbon and total nitrogen of the soils were determined with the Vario Max produced by the German Elementar Company.Results show that dry-wet alternation significantly reduced microbial diversity in the soils under no-tillage, and the effect was amplified with rising frequency and intensity of the dry-wet alternation. However, dry-wet alternation did not affect microbial diversity in the soils under ridge tillage. Compared to the control, the treatments under dry-wet alternation significantly increased the relative abundances of Planctomycetes and Verrucomicrobia in the soils under no-tillage and significantly reduced the relative abundances of Saccharibacteria and Parcubacteria in the soils under either no-tillage or ridge tillage, and increased the relative abundance of Gemmatimonadetes in the soils under ridge-tillage. Relative abundances of Proteobacteria and Acidobacteria were significantly lower in the soils under ridge tillage than in the soil under no-tillage, while that of Actinobacteria was significantly higher in the soils under ridge tillage. Relative abundances of Firmicutes and phyla in the“Others”did not vary much between the two tillage modes. Frequency of dry-wet alternation did affect structure of the soil microbial community. However, intensity of drought in the treatments did not have much effect on structure of the soil microbial community. So soil microbial community structure is significantly altered by frequency of the alternation, but not by intensity of the drought in the dry-wet alternation. Redundancy analysis was conducted with available phosphorus, readily available potassium, total N, total C and pH of soil as explanatory variables and 11 phyla of microbes in the soils under no-tillage and ridge tillage as response variables. Readily available potassium was the main environmental factor affecting the distribution and quantity of soil microorganisms.Dry-wet alternation has certain significant effects on soil microbial communities, but such effects are dependent on tillage practices and frequency of the dry-wet alternation. This study is expected to provide a theoretical basis for predicting effects of arid climate on soil ecological functions.

Tillage practice; Dry-wet alternation; Soil microbial community; Black soil; Illumina Miseq sequencing

S154

A

10.11766/trxb201808230253

劉奎，葛壯，徐英德，劉磊，葉超，李明，趙搏，梁愛珍，張彬，汪景寬. 不同耕作方式下黑土微生物群落對(duì)干濕交替的響應(yīng)[J].土壤學(xué)報(bào)，2020，57（1）：206–216.

LIU Kui，GE Zhuang，XU Yingde，LIU Lei，YE Chao，LI Ming，ZHAO Bo，LIANG Aizhen，ZHANG Bin，WANG Jingkuan. Responses of Soil Microbial Community to Drying-Wetting Alternation Relative to Tillage Mode[J]. Acta Pedologica Sinica，2020，57（1）：206–216.

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41401332）和遼寧省自然科學(xué)基金計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（20170540794）資助Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41401332）and the Natural Science Foundation of Liaoning（No. 20170540794）

，E-mail：zhangbin84@yeah.net

劉 奎（1993—），男，遼寧盤錦人，碩士研究生，主要從事土壤肥力與土壤生態(tài)研究。E-mail：505062917@qq.com

2018–08–23；

2018–11–08；

2018–11–26

（責(zé)任編輯：盧 萍）