苑學霞，梁京蕓，范麗霞，王 磊，董燕婕，趙善倉

糞肥施用土壤抗生素抗性基因來源、轉移及影響因素*

苑學霞，梁京蕓，范麗霞，王 磊，董燕婕，趙善倉?

（山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所/山東省食品質量與安全檢測技術重點實驗室，濟南 250100）

隨著新型抗生素開發(fā)速度的不斷下降以及抗性基因（Antibiotic resistant genes，ARGs）的快速出現(xiàn)和傳播，細菌抗藥性和ARGs對公共健康存在威脅，被公認為當前全球亟待解決的難題。雖然土壤本底存在ARGs，但畜禽糞便施用等人類活動加速了ARGs在土壤環(huán)境中的擴散和傳播。糞肥施入土壤后，其對土壤微生物的抗性選擇壓力及基因水平轉移導致的ARGs擴散轉移將持續(xù)存在。畜禽糞便中的抗性細菌所攜帶的ARGs、土壤中抗生素累積導致微生物產(chǎn)生的ARGs和糞肥刺激含有ARGs微生物的繁殖等均為土壤中ARGs的主要來源。土壤中ARGs可以向水體和農(nóng)作物傳移，并隨著食物鏈向動物及人類傳播。自然因素（溫度、降水、時間和土壤類型）和人為因素（抗生素的含量和種類、糞便種類和處理方式、重金屬含量及生物質炭添加）均會影響土壤中ARGs的持久和擴散。目前，糞肥施用土壤中ARGs污染對環(huán)境質量及健康的潛在影響并不完全清楚，建議加強模型建立、溯源、生物地理分布、從污染源向環(huán)境介質的轉移規(guī)律、削減措施和機制等方面研究，以有效遏制ARGs在環(huán)境中的污染，真正做到畜禽糞便資源化、無害化利用。

抗生素；抗性基因；畜禽糞便；抗性細菌；自然因素；人為因素

抗生素的發(fā)明和使用是人類醫(yī)學史上具有里程碑意義的成就，但由抗生素濫用而導致的大量抗藥性致病菌的出現(xiàn)引起了人們對抗生素及抗性基因（Antibiotic resistant genes，ARGs）的廣泛關注。隨著抗生素的不斷使用，微生物（包括病原菌和非病原菌）對抗生素的抗性逐年增加，對人類健康和環(huán)境安全構成了巨大的潛在危害[1]。歐洲每年大約2.5萬人死于抗生素抗藥細菌，美國每年至少200萬人的疾病和2.3萬人的死亡是由于抗生素抗藥性導致的[2]。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將ARGs作為21世紀威脅人類健康的最重大挑戰(zhàn)之一。2014年4月世界衛(wèi)生組織發(fā)布首份全球114個國家抗生素抗藥的監(jiān)測報告。美國從1996年開始由美國疾病控制中心（CDC）、食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和農(nóng)業(yè)部（USDA）三部門共同實施國家抗生素抗藥性監(jiān)測計劃（National Antimicrobial Resistance Monitoring System，NARMS）。我國于2016年由國家衛(wèi)生計生委等14部門聯(lián)合制定了《遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016—2020年）》。抗生素和ARGs污染已經(jīng)成為全球性的環(huán)境健康問題。

中國是畜禽養(yǎng)殖大國，全國各種規(guī)模畜禽糞便鮮重產(chǎn)量為16.29億～32.64億t[3]。畜禽糞便作為有機肥料廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。隨著集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，越來越多的抗生素用于畜禽疾病的防治。據(jù)估計，全球獸用抗生素2013年使用量約為13.1萬t，到2030年將達到20.0萬t[4]。2013年中國抗生素使用量為16.2萬t，其中52%為獸用抗生素；在36種常見抗生素中，獸用抗生素的用量為7.8萬t，占比高達84.3%[5]。這些獸用抗生素大多數(shù)不能被動物完全吸收，而是以原型或代謝物的形式排放至環(huán)境中，肉用動物使用的抗生素有30%～90%以母體化合物的形式隨糞便排出體外[6]，2013年中國36種常見抗生素排放量為5.4萬t，分別排放至土壤（54%）和水體（46%）中，其中84.0%來源于動物排泄（豬：44.4%；雞18.8%；其他動物20.9%），涉及的抗生素種類有磺胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、大環(huán)內酯類、-內酰胺類等[5]。土壤作為ARGs的重要儲存庫和介質，成為各國科學家關注和研究的熱點。

1 抗生素的作用及抗性產(chǎn)生的分子機制

抗生素和微生物抗性之間是“偵查”與“反偵查”的關系。由于抗生素是微生物的代謝產(chǎn)物，此類微生物本身就具有抗藥性，這種抗藥性為固有抗藥。另一方面，抗生素的濫用加速了ARGs與抗性細菌的產(chǎn)生和擴散?？股刈饔眉翱剐援a(chǎn)生的分子機制[1，7]詳見表1。

2 糞肥施用土壤中ARGs的來源

2.1 土壤中本底ARGs的存在

土壤中微生物數(shù)量龐大，種類極其豐富，是土壤中極為活躍的生物因子。盡管諸多研究表明人類活動與土壤中的ARGs相關，但是在未受人類影響的土壤中，微生物自身擁有豐富多樣的抗藥性及ARGs[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在3萬年前凍土中發(fā)現(xiàn)了β-內酰胺類、四環(huán)素類和糖肽類ARGs的存在[9]；在被隔離400萬年的洞穴中分離的細菌中也發(fā)現(xiàn)18個染色體抗藥性元件[10]。以上皆說明土壤微生物中ARGs的存在早于人類使用抗生素。van Goethem等[11]對尚未有人類活動的17個南極土壤樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)了177種自然存在的ARGs，其中大部分ARGs編碼一個或多個外排泵，常見的有β-內酰胺類、氯霉素類、氨基糖苷類ARGs。

2.2 動物糞便中的抗生素抗性細菌所攜帶的ARGs

動物糞便中的抗生素抗性細菌所攜帶的ARGs是土壤中ARGs的重要來源。由于抗生素的長期濫用，誘導動物體內產(chǎn)生ARGs，引發(fā)細菌抗藥性。除此之外，為了增產(chǎn)，重金屬作為動物生產(chǎn)所需要的微量元素，也被作為添加劑廣泛添加至飼料中[12]，引發(fā)了重金屬和ARGs的共選擇作用，加劇了動物腸道中ARGs的形成[13]。

表1 抗生素作用及抗性產(chǎn)生的分子機制

續(xù)表

Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)豬飼料中抗生素以及重金屬的添加會增加其腸胃微生物ARGs的豐度，ARGs的分布與微生物群落結構密切相關，其中擬桿菌門和厚壁菌門之間關系最為密切；ARGs群落變化由飼料中的抗生素和金屬添加（31.8%）、腸道微生物群落組成結構（23.3%）及二者的相互作用（16.5%）導致。肉牛飼喂四環(huán)素及引起的其他因素可增加糞便中抗藥性大腸肝菌的數(shù)量[15]。

越來越多的研究從畜禽糞便中檢測到高豐度的ARGs，如四環(huán)素類ARGs：A、C、E、G、M、O、Q和T，磺胺類ARGs：1、2和3，喹諾酮類ARGs：B、S和D，鏈霉素類ARGs：A、B，氨基糖苷類ARGs：A，大環(huán)內酯類ARGs：B、F等[16-17]。畜禽糞便中存在豐富多樣的ARGs，多種抗藥機制并存已成為一種普遍現(xiàn)象。Qu等[18]對雞盲腸中微生物進行檢測，發(fā)現(xiàn)了大量的轉座酶基因，這些轉座酶在一定程度上促進了ARGs的水平轉移，這也是雞糞中抗生素ARGs豐度高的一個重要原因。

先進技術的發(fā)展為研究ARGs提供了更好的技術手段。采用高通量定量PCR技術在加拿大一個奶牛場的牛糞中發(fā)現(xiàn)114種ARGs，其中，大環(huán)內酯-林可酰胺-鏈陽菌素B類（MLSB）28種ARGs、四環(huán)素類21種ARGs、氨基糖苷類19種ARGs、多重抗藥類18種ARGs、β-內酰胺類16種ARGs[19]。在澳大利亞一項研究中，雞糞中檢出127種ARGs、牛糞中檢出109種 ARGs、豬糞中檢出136種ARGs，其中，雞糞中有19種、牛糞中有3種、豬糞中有22種，三種糞便共同存在的有86種[20]。這表明畜禽糞便是重要的ARGs儲存庫，糞便中ARGs的豐度可能與養(yǎng)殖場中抗生素使用情況和動物類型密切相關。

2.3 土壤中抗生素累積可能導致微生物產(chǎn)生ARGs

在多家養(yǎng)殖場的糞便中檢出多種高濃度的獸用抗生素。Guo等[21]選取了江蘇16家養(yǎng)殖場53個糞便樣品發(fā)現(xiàn)，檢出率最高的為四環(huán)素類藥物，檢出濃度為54.1～5 775.6 μg·kg–1，其次為喹諾酮類藥物（8.4～435.6 μg·kg–1）、磺胺類藥物（3.2～5.2 μg·kg–1）和大環(huán)內酯類藥物（0.4 ～110.5 μg·kg–1）。Pan等[22]選取了山東21家典型集約化養(yǎng)豬場，采集并分析了126個豬糞樣本的抗生素濃度，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類檢出率為84.9%～96.8%，其中金霉素的檢出濃度最高，達到764.4 mg·kg–1，是目前為止四環(huán)素類抗生素在豬糞中檢測到的最高濃度，磺胺類抗生素的檢出率為0.9%～51.6%，其中磺胺二甲嘧啶檢出濃度最高，達到28.7 mg·kg–1。

隨著糞便和污水作為肥料施入土壤，抗生素也隨之進入土壤。在環(huán)境中，有的抗生素（如青霉素類）很容易降解，有的（如氟喹諾酮類、大環(huán)內酯類）可存在很久，容易擴散和累積[23]。在長江三角洲241個農(nóng)田土壤均檢出抗生素，其中四環(huán)素檢出頻率最高（99.6%）、其次為喹諾酮類（99.0%）和磺胺類（66.8%）[24]。在河北、河南、四川、江蘇四省53個土壤中，96.23%的土壤檢出抗生素，其中磺胺間甲氧嘧啶檢出率最高（71.70%）、土霉素檢出濃度最高（415.0 μg·kg–1）[25]。

關于抗生素濃度和ARGs的報道較多，但在同一時間和地點對這兩個參數(shù)同時量化的研究較少。對截止2018年5月的42篇同時檢測抗生素濃度和ARGs豐度的文獻進行Meta分析，抗生素壓力對ARGs豐度的增加作用顯著，即使在抗生素濃度很低的水平下也是如此[26]。在長期施用四環(huán)素殘留豬糞的土壤中發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素殘留量與四環(huán)素ARGs豐度存在著顯著的正相關關系[27]。在長期施用牛糞和雞糞的溫室土壤中，抗生素殘留量與ARGs豐度顯著正相關[28]。有研究發(fā)現(xiàn)ARGs豐度對不同抗生素的響應不同，四環(huán)素類ARGsO、W、M與土霉素含量顯著正相關，但與同為四環(huán)素類藥物的四環(huán)素、金霉素和強力霉素的相關性不顯著，磺胺甲嘧啶與磺胺類ARGs2相關性也不顯著[29]。

2.4 糞肥施用后土壤微生物群落改變

即使施用不含抗生素的有機肥，也可以顯著富集土壤中抗生素抗性微生物和ARGs，其原因是土壤養(yǎng)分的投入改變了土壤微生物群落結構組成，引起含有CEP-04基因的假單胞菌、含有β-內酰胺酶抗性的紫色桿菌和肺尖嗜冷桿菌的大量繁殖[30]。Han等[31]認為施用豬糞和雞糞通過影響土壤的理化性質，增加土壤中細菌的豐度，進而影響土壤中ARGs和移動元件（Mobile genetic elements，MGEs）的豐度；46.3%的ARGs變異可以由細菌群落（27.6%）、MGEs（8.9%）、土壤理化性質（4.2%）、細菌群落+ MGEs（1.5%）、細菌群落+土壤理化性質（1.9%）、MGEs+土壤理化性質（1.4%）和細菌群落+土壤理化性質+MGEs（0.8%）解釋。

3 糞肥施用土壤中ARGs分布及轉移

3.1 糞肥施用土壤中ARGs分布

畜禽養(yǎng)殖業(yè)向土壤輸入的ARGs不僅僅局限于養(yǎng)殖場內和養(yǎng)殖場周圍的土壤中，它還將隨著糞肥施用于農(nóng)田中而傳播至更遠的地方。在不同國家和地區(qū)、施用不同類型肥料的土壤中檢出多種多樣的ARGs和MGEs（表2）。

表2 糞肥施用土壤中抗性基因（ARGs）和移動元件（MGEs）

注：—表示文獻中未提及生長植物Note：— means that no plant information available

此外，糞肥施用對致病微生物及抗藥性的影響更應該引起注意。Pornsukarom和Thakur[44]研究發(fā)現(xiàn)土壤和豬糞中沙門氏菌的檢出率分別為10.69%和38.46%；美國北卡羅萊納州的檢出率（25.45%）極顯著高于愛荷華州（2.73%）；從豬糞及施用豬糞的土壤中分離出58.73%的沙門氏菌具有對三種或三種以上藥物的多重抗藥性。豬糞施用土壤中分離的產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌與豬糞中的基因相似度高于90%[45]。ARGs一旦存在于人類致病菌上，這些具有抗藥性的致病菌就很可能隨著糞肥的施加進入食物鏈，進而可能引發(fā)臨床感染?？傊?，環(huán)境中的致病微生物所攜帶的抗藥性及ARGs不僅是一個環(huán)境問題，更是關系到人體健康的公共衛(wèi)生問題。

3.2 土壤中ARGs的轉移

普遍認為，抗生素抗性細菌通過糞肥施用進入土壤，所攜帶的大量ARGs在環(huán)境中的持久性殘留以及在不同介質中的轉移、擴散較抗生素本身對環(huán)境的危害更大。

ARGs的傳播擴散通過兩種方式：垂直轉移和水平轉移。其中垂直轉移是指親代和子代之間通過繁殖發(fā)生的基因轉移。水平轉移是指同種或不同種屬菌株之間通過轉化、轉導和接合等方式發(fā)生的基因轉移[7]。但ARGs在土壤、水及植物中的轉移分配比例及程度尚不清楚。抗性細菌和ARGs在環(huán)境中的存在及轉移詳見圖1。

土壤和畜禽糞便中的細菌群落存在巨大差異，土壤中的微生物較糞便中的更具有競爭力[46]，糞便中的細菌在土壤中的存活時間雖然僅有幾周到幾個月，但是基因從糞便抗藥細菌到土壤土著細菌的水平轉移會導致土壤中ARGs長期持留[30]。在施用豬糞的土壤中發(fā)現(xiàn)多重抗藥沙門氏菌通過質粒介導ARGs的水平轉移[47]。糞便能刺激抗生素ARGs在土壤中的水平轉移，主要的寬宿主質粒如P-1和Q在糞便中豐度很高，質粒N和W也經(jīng)常被檢出，若ARGs在質粒中存在，質粒的多樣性使ARGs能夠在不同的細菌種屬之間進行水平轉移[48]，導致ARGs更廣泛遷移。此外，整合子是基因水平轉移的遺傳元件之一，是細菌基因組進化的熱點，它可以通過基因盒的獲得與重排進行基因水平轉移。其中，一類整合子攜帶的ARGs盒主要編碼與氨基糖苷類、β-內酰胺類和氯霉素抗性相關的ARGs[49]。

圖1 抗性細菌和ARGs在環(huán)境中轉移示意圖[50]

土壤作為重要的ARGs儲存庫，其中部分抗藥細菌及ARGs會隨著雨水的淋洗、徑流等進入水體中。水體環(huán)境是另一個重要的ARGs儲存庫，而農(nóng)田的徑流水是水體中ARGs的重要來源[51]。有研究發(fā)現(xiàn)，施用豬糞可顯著增加徑流水中Q、X、B、F的含量，并且Q、B、F受降雨的影響[52]。Fang等[53]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場中ARGs主要是通過養(yǎng)殖廢水排放、糞肥施用轉移擴散至溪水、沉積物和設施土壤中。

土壤中ARGs還會附著在農(nóng)作物中隨著食物鏈向人體及動物傳播。生長在糞肥施用土壤中的蔬菜暴露于ARGs高風險中[16]。Wang等[54]在糞肥施用土壤、植物內生菌和葉際微生物中均檢測到ARGs存在，這些抗性植物內生菌很可能來自土壤土著細菌，并在植物組織內定殖，促使ARGs從土壤轉移至植物中，對人類健康存在潛在威脅。Marti等[55]在施用豬糞的土壤以及土壤上種植的蔬菜均檢測到了多種ARGs，在施用新鮮豬糞的土壤中收獲的蔬菜檢測到一些獨有的抗生素ARGs。因此，作為糞肥中ARGs和植物ARGs的介質，土壤中ARGs的研究就顯得尤為重要。

4 糞肥施用土壤中ARGs持久性和傳播擴散的影響因素

糞肥施用土壤中ARGs持久性和傳播擴散的影響因素主要分為兩個方面，一方面是自然因素：主要包括氣候（溫度、降雨）、時間和土壤類型等；另一方面是人為因素：主要包括抗生素的含量和種類、糞肥的種類和處理方式、重金屬含量、生物質炭添加等。

4.1 自然因素

4.1.1 氣候（溫度、降雨） 關于氣候對土壤中ARGs的影響研究較少，但是土壤中溫度、含水量等均是影響土壤中微生物的重要因素，其對微生物群落的影響可能會影響土壤ARGs豐度。在長期施用四環(huán)素殘留豬糞的土壤中發(fā)現(xiàn)，合適的氣候條件對抗藥菌和ARGs形成有較好的促進作用，秋季較夏季更適合抗藥菌和ARGs形成[27]。此外，降雨影響攜帶ARGs的細菌生長和ARGs水平轉移[38]。

4.1.2 時間 糞肥攜帶的細菌在土壤中的存活時間因條件的不同差異很大。以沙門氏菌為例，在低于0℃的土壤中沙門氏菌可存活6個月以上，0～5℃可存活小于等于28周，而30℃僅存活4周。雖然糞便耐抗生素細菌會死亡，但糞便抗藥細菌攜帶的ARGs水平轉移至土壤土著細菌中。Zhang等[56]研究發(fā)現(xiàn)施肥172 d后黃壤中ARGs的豐度增加，而在紅壤和黑土中ARGs的豐度降至對照水平。也有研究表明，盡管糞肥施用土壤中ARGs的豐度隨著時間的延長而減少，但是120d后，其豐度仍然較未施肥土壤的高[31]。Zhao等[29]研究了糞肥施用1 a到大于10 a設施蔬菜地中ARGs的分布，發(fā)現(xiàn)施肥年限對ARGs含量和豐度的影響并無明顯趨勢。

4.1.3 土壤類型 不同類型的土壤其理化性質、結構、微生物組成等各不相同，因此不同類型土壤具有不同的ARGs組。有研究認為氮元素對土壤ARGs含量有很大影響[57]。與土壤中的養(yǎng)分相比，細菌對糞肥施用土壤中四環(huán)素ARGs累積發(fā)揮更重要的作用[46]。中性pH、高含量有機碳的土壤中ARGs受糞肥施用的影響最小[35]。Zhang等[56]發(fā)現(xiàn)土壤類型顯著影響糞肥施用后土壤中抗藥細菌和ARGs動態(tài)變化，在紅壤和黑土中ARGs的變化取決于微生物群落的變化，而在黃壤中基因水平轉移是影響ARGs的主要因素。

多項研究認為土壤中細菌群落組成對糞肥施用土壤中ARGs組成的影響很大。在農(nóng)田中變型菌門細菌影響ARGs的組成，而在草地中綠彎菌門和浮霉菌是主導菌[36]。Forsberg等[57]對18種農(nóng)業(yè)和草地土壤進行18種抗生素抗性的功能元基因組篩選，發(fā)現(xiàn)細菌群落組成（而不是水平轉移）是土壤中抗生素抗性的主要決定因素。因此，維持或增加土壤微生物的多樣性可能對緩解土壤中ARGs的擴散和累積有效果。

4.2 人為因素

4.2.1 抗生素的含量和種類 關于土壤中抗生素和ARGs之間的關系在2.3中已做論述，但也許抗生素和ARGs的環(huán)境共存并不一定是單純的因果關系。它們通常同時被排放至環(huán)境中，遵循類似的路徑。但不同的是，抗生素在環(huán)境中可降解，而ARGs不是“可降解的污染物”，而是在環(huán)境中可自動復制、增殖或減少的元件，ARGs的持久性和擴散途徑更加多樣和復雜。

4.2.2 糞便種類和處理方式 作為一種常用的農(nóng)業(yè)措施，糞肥施用會導致大量微生物（包括抗性細菌和潛在的人類病原菌）進入土壤。功能元基因組學分析表明，施用有機肥后肥料源ARGs占土壤中ARG總量的70%以上[58]。豬糞、牛糞、雞糞是施用最廣泛的三種糞肥類型，由于動物和飼養(yǎng)方式不同，不同動物糞便中含有不同ARGs。有研究發(fā)現(xiàn)糞便中ARGs豐度由高到低的順序依次為豬糞、雞糞、牛糞[20]。Peng等[59]發(fā)現(xiàn)糞肥施用30 a后，豬糞顯著增加了土壤中ARGs豐度，而施用牛糞的作用不明顯。土壤中攜帶ARGs的細菌生長和ARGs水平轉移也受糞便類型的影響[38]。

好氧堆肥是畜禽糞便無害化處理和資源化利用的重要方式。Gou等[19]發(fā)現(xiàn)好氧堆肥可顯著降低牛糞和土壤中ARGs的豐度和多樣性，并且在施用堆肥土壤中ARGs與MGEs的相關性弱于施用新鮮糞便的土壤中。但也有研究發(fā)現(xiàn)堆肥處理增加了糞便中的X的豐度，但土壤中未變化，而在糞便和土壤中G均有增加[56]。

厭氧消化在畜禽糞便處理和沼氣生產(chǎn)中有著廣泛的應用。厭氧消化降低了沼氣殘渣中四環(huán)素ARGs和大環(huán)內酯類、林可酰胺類、鏈陽性菌素類（MLSB）ARGs；但磺胺類、氨基糖苷類和氟苯尼考、氯霉素和胺酰醇類ARGs增加了幾十倍甚至幾百倍[32]。長時間低溶氧可加速豬場糞水中ARGs的去除[60]。高固體厭氧消化過程中游離氨的不足和揮發(fā)性脂肪酸（特別是丙酸）的積累減緩了豬糞中ARGs的降低[61]。

4.2.3 重金屬含量 為了增強畜禽防病能力、提高畜禽生長性能，重金屬在規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖中的濫用現(xiàn)象導致畜禽糞便中重金屬富集。在豬糞堆肥過程中銅抗性基因、ARGs、I1間存在共生關系，其中，基因A、B、A、B及I1豐度降低，而基因A和A豐度升高；高濃度銅離子降低銅抗性基因、ARGs、I1的傳播效率[62]。糞肥施用30年的土壤中Cu、Zn、Pb含量增加，并且與G、O、W、B（P）、1、2、B和F成顯著正相關，表明重金屬參與細菌抗藥性共選擇過程。而Cu、Zn、Pb含量與MGEsl1的正相關關系表明三種重金屬可能參與ARGs的轉移[59]。即使是亞劑量的重金屬也會促進質粒介導的ARGs水平轉移[63]。此外，納米級鋁也被發(fā)現(xiàn)能夠引起ARGs的水平轉移，對ARGs的接合、轉化和轉導過程均有促進作用，這與其影響細胞膜狀態(tài)和調控基因表達有關，而正常鋁對ARGs無影響[64]。

4.2.4 生物質炭添加 生物質炭是在無空氣的情況下生物質熱解過程中形成的一種富碳固體，通過參與π-π電子供體、受體表面與抗生素的相互作用，有可能降低土壤溶液中抗生素的濃度。在含有高豐度ARGs的有機肥污染土壤中，生物質炭的添加降低了土壤、生菜葉片和根系中ARGs的豐度[65]。但也有研究得出不同的結果：添加生物質炭30 d后土壤中ARGs顯著降低，而60 d后，添加生物質炭的土壤中ARGs顯著高于對照[66]；添加生物質炭可顯著降低土壤中ARGs的豐度，但在生長植物的土壤，生物質炭的作用不明顯[67]。

5 研究展望

盡管多項研究證明抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用及畜禽糞便的施用促進了細菌抗藥性的產(chǎn)生，但其對環(huán)境質量及健康的潛在影響并不完全清楚。由于抗生素使用和糞肥施用過程中一系列的相互作用，相關的非生物學和生物學機制非常復雜。雖然諸多研究認為選擇性突變和基因水平轉移機制是ARGs在環(huán)境中不同介質之間存在和轉移的主要原因，但也不排除與環(huán)境中其他因素協(xié)同作用的可能。因此，有必要深入開展實地試驗和模型建立工作，將其他生物和非生物參數(shù)（土壤動物、營養(yǎng)物質）、抗藥性共同選擇劑（多種重金屬）和污染類型（污水、糞便污染、灌溉）等多種因素結合起來，避免由于數(shù)據(jù)來源、設計和方法不同帶來的模型預測能力有限和不確定性。

由于ARGs本身是一種自然現(xiàn)象，環(huán)境中廣泛存在抗藥性本底值，因此難以區(qū)分、辨別由人類活動（如畜禽養(yǎng)殖）引起的抗藥性和自然本底抗藥性，對ARGs進行溯源成為一種新的挑戰(zhàn)。因此，有必要對以下三方面進行深入研究：1）具有指示作用的ARGs；2）可能的潛在性基因宿主微生物；3）采用不同類別的ARGs建立模型，用于追溯抗生素抗藥來源。

微生物功能基因與地理距離相關，具有生物地理上的地方特性。對于ARGs大尺度地理分布格局的研究可以增加人們對ARGs在生態(tài)系統(tǒng)中擴散機制的認識。對于ARGs是否顯示出距離衰減關系，以及驅動微生物分類群落的生物地理學的四個基本過程（選擇、漂移、擴散和突變）影響ARGs的生物地理模式需要深入研究。

隨著科技的發(fā)展，高通量測序、生物信息學和現(xiàn)代統(tǒng)計分析技術的發(fā)展為多尺度、多層次研究ARGs的發(fā)生、轉移和擴散途徑及機制提供了科學手段。應該對ARGs從污染源向土壤、地下水、地表水及植物介質中的傳播規(guī)律、削減措施及機制開展更深入研究，以期有效遏制ARGs在環(huán)境中的污染，真正做到畜禽糞便的無害化和資源化利用。

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Effects of Manure Application on Source and Transport of Antibiotic Resistant Genes in Soil and Their Affecting Factors

YUAN Xuexia, LIANG Jingyun, FAN Lixia, WANG Lei, DONG Yanjie, ZHAO Shancang?

(Institute of Quality Standard and Test Technology for Agro-products, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Test Technology on Food Quality and Safety, Jinan 250100, China)

With new antibiotics slowing down in development and antibiotic resistant genes (ARGs) popping up and spreading rapidly, antibiotic resistant bacteria (ARB) and ARGs have become imminent threats to public health and a global problem urgently calling for solution. Nowadays, the industry of livestock breeding still abuses the use of veterinary antibiotics in concentrated feeding operation in an attempt to improve growth and control diseases. It is estimated that approximately 30%～50% of the administered antibiotics are excreted with waste instead of being absorbed by animals. Manure is commonly used as a substitute for inorganic N and P fertilizers for agricultural crops, especially in organic farming. In 2013, a total of 54 000 tons of 36 antibiotics was excreted in China, 54% into the soil and 46% into the water environment. The antibiotics involved include sulfonamides, tetracycline, fluoroquinolones, macrolides, β-lactam, etc. The ARGs contained in the ARB excreted with manure, generated in microbes as a result of accumulation of antibiotics in soil, and multiplied with the proliferation of ARGs-containing microbes stimulated by manure are the main sources of ARGs in the soil. Bacterial communities in manure and in soil vary sharply in structure. The bacteria in feces can survive in soil for weeks to months, depending on soil and environment, however, horizontal gene transfer from these bacteria to indigenous soil bacteria might rely on persistence of ARGs in soil. As one of the largest and most diverse microbial habitats on earth, soil has been the source of most discovered ARGs, supplying ARGs to water environment, crops, and animals and human through food chain. Once ARB and their corresponding suite of ARGs enter the soil, water and crops, their persistence and fate depend on nature and viability status of their host bacteria and their living environment. Both natural factors, like temperature, rainfall, time and soil type, and human factors, like content and specie of antibiotic, type and treatment of manure, content of heavy metal and biochar addition, could affect persistence and diffusion of ARGs in soil. However, the impacts of manure application contaminating the soil with ARGs on environmental quality and human health still remain unclear. It is, therefore, suggested that studies should be intensified on modelling, source tracing, biogeographical distribution, rules of ARGs transferring from sources to environmental media, measures to reduce and mechanisms of reducing the transfer, which will help to recycle animal waste safely and control pollution of ARGs in the environment effectively.

Antibiotics; Antibiotic resistant genes (ARGs); Livestock feces; Antibiotic resistant bacteria (ARB); Natural factor; Human factor

X171.5

A

10.11766/trxb201903110049

苑學霞，梁京蕓，范麗霞，王磊，董燕婕，趙善倉. 糞肥施用土壤抗生素抗性基因來源、轉移及影響因素[J]. 土壤學報，2020，57（1）：36–47.

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* 國家自然科學基金項目（41907073）和國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0501407，2016YFE0109200）資助Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41907073）and the National Key Research and Development Program of China（Nos. 2016YFD0501407 and 2016YFE0109200）

，E-mail：shancangzhao@126.com

苑學霞（1980—），女，山東濰坊人，博士，副研究員，從事農(nóng)業(yè)環(huán)境安全與風險評估研究。E-mail：xuexiayuan@163.com

2019–03–11；

2019–06–27；

2019–07–18

（責任編輯：陳榮府）