李青峰，奎翔，易曉佳，王小芳，王燕

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 病理科，云南 昆明 650100

酪氨酸激酶底物（tyrosine kinase substrate，TKS）適配蛋白由N端PHOX同源（PX）結(jié)構(gòu)域及多個酪氨酸激酶Src同源3（SH3）結(jié)構(gòu)域組成，富含脯氨酸區(qū)域（PRR）和Src磷酸化位點。SH3結(jié)構(gòu)域、Src磷酸化位點和PRR基序有助于與其他蛋白結(jié)合；PX結(jié)構(gòu)域?qū)儆诹字＜〈冀Y(jié)合模塊超家族成員，參與TKS蛋白與磷脂的結(jié)合[1]，使得它們相互作用并協(xié)調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的發(fā)生。侵襲性偽足和足小體是其重要的表現(xiàn)形式。侵襲性偽足通常用于描述癌細胞中的結(jié)構(gòu)，而足小體是指與非癌細胞中的基質(zhì)重塑有關(guān)的類似結(jié)構(gòu)，包括樹突狀細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和破骨細胞[2]。對侵襲性偽足的研究較廣泛，主要關(guān)注細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等方面。侵襲性偽足表現(xiàn)為腹側(cè)質(zhì)膜的肌動蛋白突起，并含有能夠降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的蛋白酶，與人體癌細胞形成及其體內(nèi)、外侵襲力有關(guān)[3-5]。Cejudo-Martin等[6]研究表明，足小體的基本成分的缺失是導(dǎo)致多種人類綜合征的主要原因，其中一些癥狀的特點是顱面部、骨骼和心臟發(fā)育嚴重缺陷，且預(yù)后很差。同樣，TKS蛋白中的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在 Src轉(zhuǎn)化細胞中對癌細胞的侵襲性偽足和足小體的形成和功能均有調(diào)節(jié)作用[7]，最主要體現(xiàn)在TKS4和TKS5蛋白。目前有關(guān)TKS蛋白亞型TKS4和TKS5的研究甚多，主要涉及侵襲性偽足和足小體在腫瘤中的意義，但分子機制和信號通路研究較少。

1 TKS4和TKS5

TKS4（TKS with four SH3 domains）和 TKS5（TKS with five SH3 domains）的結(jié)構(gòu)整體相似，在功能上有一定的重疊，都有N端PX結(jié)構(gòu)域，前者帶有4個SH3域，后者帶有5個SH3域，在人體中二者的整體結(jié)構(gòu)相似性為36%。TKS4和TKS5分布廣泛，存在于從魚到人的各種脊椎動物中。

TKS4編碼基因位于人5號常染色體上，帶有4個SH3域，是一種新型支架蛋白，在細胞粘連形成中發(fā)揮重要作用[8-9]。在對Src轉(zhuǎn)化成纖維細胞的研究中，發(fā)現(xiàn)TKS4是形成足小體的關(guān)鍵因子，是一種動態(tài)的富含肌動蛋白的質(zhì)膜突起，參與了細胞黏附、遷移和基質(zhì)降解。同時，TKS4調(diào)節(jié)膜Ⅰ型基質(zhì)金屬蛋白酶（membrane type 1 matrix metalloproteinases，MT1-MMP）的定位、分泌和穩(wěn)定，促進了ECM蛋白水解并介導(dǎo)腫瘤侵襲能力的增加[10-11]。TKS4蛋白是一個可調(diào)控蛋白，在足小體形成、細胞遷移、間充質(zhì)干細胞分化和骨小梁形成中發(fā)揮重要作用，同時TKS4也是促進腫瘤侵襲力的關(guān)鍵因子之一[12]，對于其機制和功能的研究很有必要。

TKS5編碼基因位于10號染色體，帶有5個SH3域，是形成侵襲性偽足的關(guān)鍵支架蛋白，Src介導(dǎo)的TKS5酪氨酸557/619位點磷酸化，進行侵襲性偽足相關(guān)蛋白招募，最終形成侵襲性偽足，促進癌細胞遷移。TKS5在侵襲性癌細胞中表達，在非侵襲性細胞中不表達，這表明TKS5可能在侵襲性偽足形成啟動過程中起核心作用，同時也是人類癌細胞基質(zhì)侵襲所必需的因子之一[13-14]。

2 TKS4與腫瘤

在腫瘤的研究中，TKS4呈現(xiàn)出負調(diào)控機制。研究表明[15]TKS4支架蛋白與癌癥進展有一定的關(guān)聯(lián)，目前TKS4在幾種癌癥類型中的作用已被提及，包括乳腺癌[16]、黑色素瘤、急性髓細胞白血病和前列腺癌[17]。TKS4作為一種關(guān)鍵的內(nèi)毒素標記蛋白，是用來監(jiān)測結(jié)腸癌和乳腺癌細胞在體內(nèi)、外侵襲能力的標志物之一[18]。

2.1 TKS4與黑色素瘤

黑色素瘤是一種高度惡性腫瘤，一旦腫瘤發(fā)生，轉(zhuǎn)移率極高，對患者的生命造成巨大的威脅。研究顯示[11,19]TKS4是黑色素瘤生長的重要調(diào)節(jié)因子，在人類黑色素瘤中高表達，在侵襲性癌細胞中明顯過度表達，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，更多可能與侵襲性高低程度有關(guān)，影響患者的預(yù)后。

2.2 TKS4與急性髓細胞白血病

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病?？寺⌒缘陌籽〖毎驗樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。Li等[28]利用生物信息學分析得出，急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）相關(guān)基因的缺失和異常甲基化與TKS4有關(guān)系，表明AML表觀遺傳學發(fā)病機制對AML的精準治療有重大意義。同樣，TKS4被證明在各種體外模型中促進腫瘤細胞的遷移，并且在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能方面及在腫瘤誘導(dǎo)血管生成中可能起重要作用[20]，對腫瘤的生長起助推器的效果，加重患者病情。

2.3 TKS4與遺傳性疾病

TKS4基因純合突變會導(dǎo)致名為弗蘭克-泰爾哈爾綜合征（Frank-ter Haar syndrome，F(xiàn)THS）的遺傳性疾病，患者表現(xiàn)出幾種與組織發(fā)育異常相關(guān)的嚴重癥狀，如伴有或不伴有青光眼的大角膜、短頭畸形、較大的前顴骨、端頭過長、鼻孔前傾、胸腰椎后凸和手短及心臟異常。TKS4的缺失也會干擾骨骼形成，最終會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[21]，表明功能失調(diào)的TKS4很可能與FTHS表型的發(fā)展有關(guān)。同時TKS4突變導(dǎo)致Borrone皮膚骨骼-心臟骨骼綜合征（Borrone dermato-cardio-skeletal syndrome，BDCSS），其特征是心臟二尖瓣發(fā)育缺陷，由于細胞骨架結(jié)構(gòu)的缺陷導(dǎo)致組織內(nèi)細胞運動能力受損，可見TKS4對于機體正常功能調(diào)控的重要性[22]。TKS4的過表達促進了腫瘤侵襲、血管生成及疾病發(fā)展，TKS4的缺失造成了機體功能發(fā)育不全。

TKS4在生理和病理情況下發(fā)揮著相反的作用機制，在生理情況下是調(diào)控機體生長發(fā)育的重要因子之一，在病理情況下則促進了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，體現(xiàn)出促癌基因的作用。在未來腫瘤疾病研究中，該因子可能成為潛在的應(yīng)用靶標，對臨床個性化治療提供幫助。

2.4 TKS4相關(guān)機制研究

在生理情況下TKS4表現(xiàn)為良性調(diào)控蛋白，在機體功能和發(fā)育中起正調(diào)控作用。研究表明[13]，TKS4在足小體形成、細胞產(chǎn)生ROS以及白色脂肪組織的分化中發(fā)揮重要正向作用。例如，在骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）中，TKS4是成脂分化和成骨分化的潛在調(diào)節(jié)因子，同時也參與正常胚胎細胞的發(fā)育，發(fā)揮十分重要的正向調(diào)控機制[12,14,23]。Mehes等[20]認為TKS4是足小體和片狀脂質(zhì)體中細胞骨架結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組織者之一，對于調(diào)節(jié)細胞的遷移和侵襲力是必不可少的因子。Vas等[24]通過近交小鼠圖譜分析，得出TKS4是顱面骨形態(tài)正常發(fā)育的必需因子。Szeder等[25]認為TKS4是一種新上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）的調(diào)控因子，它通過改變EMT來調(diào)控TKS4的表達水平而發(fā)揮作用。

TKS4的功能研究表明其在正常機體發(fā)育中是不可或缺的重要調(diào)節(jié)因子，為相關(guān)功能性疾病缺陷研究提供了重要的理論支持，也為藥物研發(fā)和靶向治療提供了依據(jù)和參考。

3 TKS5與腫瘤

目前對TKS5在好發(fā)腫瘤中的研究較廣泛，已知在膠質(zhì)性腦腫瘤、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等中均高表達，具有一定的臨床意義。

3.1 TKS5與乳腺癌

乳腺癌是發(fā)生于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，其病因尚未完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)病存在一定的規(guī)律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。研究表明，通過對Src-3T3纖維肉瘤細胞和MDA-MB-231乳腺癌細胞在TKS5基因敲除前后的生長分析顯示，該腫瘤的血管生成減少，凋亡率增加，腫瘤生長速度變緩慢，說明該基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了促癌基因的作用[27]。Blouw等[32]通過免疫組織化學和RNA測序的方法，分析TKS5在乳腺癌進展中的作用，得出TKS5在約50%的原發(fā)性浸潤性乳腺癌患者中高表達，此外，TKS5高表達與不良預(yù)后相關(guān)，特別是在Ⅰ/Ⅱ期疾病晚期復(fù)發(fā)患者中，為TKS5在乳腺癌中的作用機制及后續(xù)研究提供了理論支撐。

3.2 TKS5與前列腺癌

前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，通常與家族遺傳關(guān)系密切。Caires-Dos-Santos等[17]分析，層粘連蛋白C16刺激Src和支架蛋白TKS4和TKS5的表達，促進了前列腺癌的侵襲力。Burger等[26]用免疫組化方法檢測92例前列腺組織和正常前列腺組織中的TKS5，同時對野生型和突變型Src和TKS5在LNCAP和PC-3前列腺癌細胞系中的表達和活性進行調(diào)控，確定Src-TKS5信號在內(nèi)胚層發(fā)育、基質(zhì)重塑活動、轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用，得出在高GLEASON評分的前列腺腫瘤標本和侵襲性前列腺癌細胞系中，Src被激活，TKS5被上調(diào)，提示了Src-TKS5信號在前列腺腫瘤進展中的一般作用及TKS5可能作為該疾病分期的標記因子之一。

3.3 TKS5與肺癌

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。研究發(fā)現(xiàn)TKS5有 3種亞型，即 TKS5α（TKS5long）、TKS5β和TKS5short[27]。Li等[28]分析了 TKS5long和 TKS5short與肺腺癌的相關(guān)型，發(fā)現(xiàn)TKS5long高表達和TKS5short低表達與肺腺癌患者的轉(zhuǎn)移進展相關(guān)，并可以作為預(yù)測早期疾病患者的生存不良指標之一，提示TKS5long到TKS5short表達可以作為評估原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移潛能和識別早期患者的預(yù)后指標，通過抑制TKS5long功能或增強TKS5Short活性的分子治療策略，未來可能有助于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移進展。

腫瘤中TKS5的高表達與患者預(yù)后的關(guān)系極為緊密，可以進一步為臨床研究提供理論和用藥上的支撐。同時，對好發(fā)腫瘤的研究表明TKS5可能是潛在的分子指標，在未來腫瘤的靶向治療中意義極大。

3.4 TKS5的靶向研究

靶向治療，是在細胞分子水平上針對已經(jīng)明確的致癌位點的治療方式。研究表明[19,29]TKS5β和TKS5Short在胚胎成纖維細胞中高表達，Tks5α則在癌細中廣泛表達，對于TKS5及亞型在癌細胞中的研究可提供理論參考。在腹膜間皮細胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）中，TKS5的表達可導(dǎo)致胃癌細胞的侵襲，同時還可以促進癌細胞黏附于腹膜表面促進癌細胞在腹壁生長，表明TKS5可能是預(yù)防腹膜癌的潛在靶點[30]，為開發(fā)抑制腹膜癌播散的藥物提供了理論支持。TKS5的表達還可誘導(dǎo)腫瘤血管生成[32]，在侵襲性癌細胞中，TKS5過度表達與侵襲程度有關(guān)，同時TKS5過度表達的腫瘤的轉(zhuǎn)移率也較高[3,11]。Stanley等[31]通過對免疫組織化學實驗和ONCOMIN數(shù)據(jù)庫信息的挖掘發(fā)現(xiàn)，與卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌的原發(fā)腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤中TKS5 mRNA表達增強的程度更高，且在一些腫瘤的轉(zhuǎn)移事件增加和預(yù)后較差的癌癥中的過度表達之間存在很強的相關(guān)性，TKS5可作為相關(guān)預(yù)后標志物在癌癥中的潛在因子，對未來的靶向治療具有重要的理論參考價值。Iizuka等[19]用組織芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)TKS在黑色素瘤中高表達，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中的表達高于原發(fā)黑色素瘤，且TKS5水平隨疾病進展而增加，可作為黑色素瘤靶向治療和預(yù)后的指標提供參考。

上述研究表明TKS5是一個促癌因子，其高表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，可能參與相關(guān)的信號通路，作為預(yù)后指標的潛能極大，對于日后相關(guān)機制研究和靶向藥物治療提供了參考。

3.5 TKS5的相關(guān)機制研究

研究表明，TKS5缺失阻礙了斑馬魚體內(nèi)神經(jīng)嵴細胞從背側(cè)到腹側(cè)的遷移和足體突起的形成，最終導(dǎo)致斑馬魚發(fā)育缺陷，表明TKS5是胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)嵴細胞遷移的必需分子之一[14,33]。在小鼠實驗中，以TKS5基因為靶點的基因陷阱導(dǎo)致TKS5α丟失，新生小鼠死亡，并伴有明顯的腭部形成缺陷，進一步支持了TKS5在神經(jīng)嵴衍生細胞類型中的作用，表明了TKS5亞型對于哺乳動物機體發(fā)育的重要性[27]。

綜上所述，TKS5可能是一個潛在的癌癥預(yù)后指標，同時也是相關(guān)的分子靶點，在未來抗癌藥物研發(fā)中，有望對攜帶TKS5過表達腫瘤的患者進行個性化治療提供幫助。

4 TKS4、TKS5與EGF信號通路

TKS4和TKS5屬于Src家族，同時也被認為是表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和其他受體下游分子傳遞信號的成員，對正常細胞和腫瘤細胞足小體、侵襲性偽足的形成發(fā)揮重要作用[8]。Vas等[12]分析得出TKS4在表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)建立了平臺，使得TKS4及其下游信號是脂肪細胞功能和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptorr-gamma，PPARγ）介導(dǎo)的白色脂肪向米色脂肪組織轉(zhuǎn)化新的調(diào)控因子。同時TKS4可能通過延遲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或改變其動力學，在EGF通路中發(fā)揮潛在的負調(diào)控作用。B?gel等[35]證明TKS4通過與EGFR形成復(fù)合物而參與EGF信號通路，并在EGF刺激下使酪氨酸磷酸化，促進細胞遷移。Fekete等[13]認為TKS5是EGF信號通路的新成分，EGF介導(dǎo)細胞導(dǎo)致TKS5磷酸化水平的持續(xù)升高并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，并且調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的重排，從而形成侵襲偽足造成細胞遷移。研究表明[26,36-37]Src在人Y558或Y620殘基上磷酸化的TKS5對于TKS5α介導(dǎo)侵襲性偽足形成和癌細胞侵襲力以及神經(jīng)嵴細胞遷移和足小體形成至關(guān)重要。

TKS4和TKS5參與EGF信號通路的調(diào)控，是否調(diào)控了上下游相關(guān)蛋白，是否參與某種疾病的發(fā)生機制，尚有待探討。

5 結(jié)語

TKS4和TKS5作為TKS經(jīng)典亞型蛋白，在腫瘤方面的研究有一定進展，但其分子機制尚不明確。對其結(jié)構(gòu)和功能的研究表明，TKS4和TKS5對于侵襲性偽足的形成、癌細胞的體外侵襲和體內(nèi)腫瘤生長都是必需的因子，同時在機體正常功能發(fā)育中也不可或缺，兩者的功能部分重疊。大量研究表明TKS4和TKS5是靶向治療及藥物開發(fā)研究中的關(guān)鍵因素，但兩者在腫瘤和臨床中的研究還不夠深入，癌細胞利用侵襲性偽足進行侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學行為是否普遍，是否具有極高的臨床意義，有待進一步探討。