荊綺,龐靖祥,楊美娜,閔令圓,周寶宸,韓金祥1，△

(1.生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，濟(jì)南 250062；2.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250062)

1 引 言

生物超微弱發(fā)光(Ultra-weak photon emission，UPE)是指在氧化代謝或氧化應(yīng)激過程中形成電子，激發(fā)物種的生物系統(tǒng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光，是光生物中唯一與其他由光產(chǎn)生的生物效應(yīng)相反的過程[1]。生物超微弱發(fā)光與生物體內(nèi)能量代謝有所關(guān)聯(lián)，是一種極其微弱的低水平化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度僅為100～103 hv/(s·cm2),波長范圍為180～800 nm[2-3]。目前研究表明，超微弱發(fā)光與生物體內(nèi)的信息傳遞[4-5]、光合作用[6]、細(xì)胞分裂[7-9]等基本生命過程密切相關(guān)。因而，生物超微弱發(fā)光檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究[10-12]、農(nóng)業(yè)發(fā)展[13-15]、食品檢驗[16-17]等許多領(lǐng)域都有應(yīng)用?？墒窃摷夹g(shù)發(fā)展至今，關(guān)于超微弱發(fā)光的發(fā)生機(jī)制仍未有明確定論?？茖W(xué)家們分別從物理和化學(xué)兩個方面提出“代謝發(fā)光”[1]和“相干輻射”[18]兩種機(jī)制，其中，超微弱發(fā)光強(qiáng)度經(jīng)大量研究證明與能量代謝密切[5,19-21]相關(guān)。因此，代謝發(fā)光理論被越來越多的學(xué)者接受。在“代謝發(fā)光”理論中，認(rèn)為生物超微弱發(fā)光過程中涉及的電子激發(fā)物種主要由生物體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的相關(guān)反應(yīng)生成[5]，由此可見，生物超微弱發(fā)光強(qiáng)度與生物體內(nèi)活性氧含量有密切聯(lián)系，所以本研究就生物超微弱發(fā)光與生物體內(nèi)活性氧含量的聯(lián)系與應(yīng)用作一綜述。

2 生物體內(nèi)的活性氧

活性氧簇主要是指生物體內(nèi)的自由基O2·-和HO·以及非自由基H2O2和1O2等物質(zhì)。在正常的動物和植物細(xì)胞生長繁殖過程中，活性氧簇的形成與生物體內(nèi)的能量代謝過程有關(guān)。首先，活性氧主要由細(xì)胞中的線粒體產(chǎn)生。在細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用時，超氧陰離子O2·-的形成是由于線粒體膜內(nèi)的復(fù)合物I和復(fù)合物III向分子氧提供電子，分子氧的單電子被還原為O2·-[22]；過氧化氫H2O2則是由O2·-的單電子還原或分子氧的雙電子還原形成的。其次，在細(xì)胞中的其他部位(如葉綠體、細(xì)胞質(zhì)等)也可發(fā)生相關(guān)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧[23-27]?？傊?，在正常的生物體內(nèi)，活性氧不斷生成，也不斷被其體內(nèi)保護(hù)酶，如：超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶 (catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-px) 及一些低分子量抗氧化劑清除[5]，因此，使生物體內(nèi)達(dá)到活性氧生成與消除的動態(tài)平衡。

在機(jī)體非正常狀態(tài)中，某些異常的氧化代謝反應(yīng)使內(nèi)部活性氧含量增加。首先，在動物細(xì)胞中，當(dāng)有微生物入侵者侵襲機(jī)體時，免疫細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中的氧化代謝反應(yīng)會產(chǎn)生大量活性氧。先天免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞)在吞噬微生物入侵者的過程中，通過增加NADPH氧化酶的活性以及耗氧量來產(chǎn)生超氧陰離子O2·-和過氧化氫H2O2等氧代謝產(chǎn)物，并利用這些氧代謝產(chǎn)物來增強(qiáng)抗菌活性[28-30]，該過程被稱為呼吸爆發(fā)[31]。在呼吸爆發(fā)期間，NADPH氧化酶在細(xì)胞防御的活性氧生成中起著重要作用，可生成大量超氧陰離子自由基O2·-[32-33]，而超氧陰離子自由基O2·-是形成各種活性氧物種(主要包括過氧化氫H2O2和羥基自由基OH·)的初始底物。因此，當(dāng)動物細(xì)胞處于呼吸爆發(fā)期間時，活性氧含量會升高。其次，研究表明，機(jī)體內(nèi)活性氧含量變化與許多慢性疾病有關(guān)，如癌癥[34-35]、心血管疾病[36-37]以及糖尿病[38]等。在這些慢性疾病發(fā)生、發(fā)展過程中，生物體內(nèi)抗氧化酶活性下降，因此，生物體內(nèi)活性氧含量升高。最后，某些化學(xué)試劑也會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。例如，過氧化氫H2O2可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，這是因為用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞后，細(xì)胞中內(nèi)源性金屬氧化酶會與H2O2發(fā)生反應(yīng)，使H2O2被分解成一個羥基自由基HO·和一個氫氧化物離子OH-，使細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加[39]。綜上所述，在機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧生成與消除的動態(tài)平衡被打破，會使機(jī)體處于活性氧含量升高的異常生理狀態(tài)，而超微弱發(fā)光強(qiáng)度與機(jī)體內(nèi)活性氧的含量高低存在一定聯(lián)系，因此，可以運用超微弱發(fā)光技術(shù)監(jiān)測機(jī)體在活性氧含量升高時的異常生理狀態(tài)。

3 生物超微弱發(fā)光與機(jī)體內(nèi)活性氧含量及能量代謝的聯(lián)系

研究表明，生物超微弱發(fā)光與生物體內(nèi)活性氧含量有關(guān)，但并非活性氧自身直接產(chǎn)生超微弱發(fā)光，而是通過脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸氧化產(chǎn)生[40]。脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是由多種不飽和脂肪酸氧化引發(fā)的自由基連鎖反應(yīng)，亞油酸是膜中的主要脂肪酸之一，亞油酸氧化后生成脂質(zhì)烷基自由基R·，在分子氧存在下，形成脂質(zhì)過氧化物自由基ROO·[41]。因此，在細(xì)胞中加入外源性亞油酸可以引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。實驗發(fā)現(xiàn)亞油酸顯著增加了與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累相關(guān)的超弱光子發(fā)射。Khabir等[42]人在實驗中增加牛血清白蛋白水溶液中H2O2的濃度，可誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基化合物，超微弱發(fā)光的檢測靈敏度顯著提高。同時，研究發(fā)現(xiàn)過氧化的核酸也可增強(qiáng)生物超微弱發(fā)光[43]。進(jìn)一步研究表明，在機(jī)體產(chǎn)生過量活性氧的情況下，活性氧的形成超過了抗氧化系統(tǒng)的能力，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化[40]，即RoOH被氧化成ROO·，再復(fù)合形成高度不穩(wěn)定中間體[44]ROOOOR，高能中間體能再分解形成激發(fā)電子態(tài)(如三重態(tài)羰基、單重態(tài)氧等)產(chǎn)物。由于ROOR或ROOOOR的分解導(dǎo)致3R=O的形成，3R=O已知在光譜的近UVA和藍(lán)綠色區(qū)域發(fā)射光子；三重態(tài)-單重態(tài)和三重態(tài)-三重態(tài)能量經(jīng)過3R=O形成單線和三重線激發(fā)色素，分別在光譜的綠-紅(550～750 nm)和近紅外(750～1 000 nm)區(qū)域發(fā)射光子；從3R=O到分子氧的三重態(tài)-單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致在光譜的紅區(qū)和近紅外區(qū)形成已知發(fā)射光子的1O2[20]。

總之，生物體內(nèi)活性氧含量增加會使生物超微弱發(fā)光強(qiáng)度有所增強(qiáng)[20,36,45]。因此，超微弱發(fā)光是一種潛在的監(jiān)測涉及生物體內(nèi)活性氧變化的氧化代謝或氧化應(yīng)激過程的新工具[19]。

4 超微弱發(fā)光技術(shù)在疾病檢測中的應(yīng)用

在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，Burgos等[19]用全反式維甲酸處理HL-60細(xì)胞使其分化為能夠產(chǎn)生大量活性氧的中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞，再用佛波酯PMA誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)，最終產(chǎn)生大量活性氧，增加超微弱發(fā)光的釋放，因此，超微弱發(fā)光技術(shù)可用來建立呼吸爆發(fā)和響應(yīng)PMA刺激增加的活性氧水平之間的聯(lián)系；在Burgos等[10]人對該問題的進(jìn)一步研究中，發(fā)現(xiàn)急性髓系白血病細(xì)胞在靜息狀態(tài)下產(chǎn)生一個微弱的超微弱發(fā)光信號，當(dāng)細(xì)胞被PMA誘導(dǎo)產(chǎn)生呼吸爆發(fā)時，超微弱發(fā)光信號明顯增加，這表明超微弱發(fā)光分析可以檢測急性髓系白血病細(xì)胞中的活性氧產(chǎn)生水平和抗氧化活性；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，用白花蛇毒和羅布麻素清除活性氧，超微弱發(fā)光信號相應(yīng)減弱，因此，超微弱發(fā)光檢測技術(shù)未來也許可以作為一種預(yù)后指標(biāo)，應(yīng)用于急性髓細(xì)胞白血病的治療。在皮膚組織的氧化應(yīng)激研究中，發(fā)現(xiàn)暴露在紫外線下，會導(dǎo)致皮膚組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，活性氧含量增加，超微弱發(fā)光強(qiáng)度升高[42,46]，因此，可利用超微弱發(fā)光技術(shù)監(jiān)測光導(dǎo)致皮膚的氧化應(yīng)激程度，并期待超微弱發(fā)光技術(shù)在皮膚的氧化應(yīng)激和皮膚癌相關(guān)研究中有所應(yīng)用[47-48]。在神經(jīng)學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)實驗動物腦片的光子發(fā)射與線粒體內(nèi)呼吸鏈產(chǎn)生的活性氧有關(guān)[49-50]，腦超微弱光子發(fā)射成像作為一種新的方法，有可能提取與神經(jīng)代謝和神經(jīng)細(xì)胞氧化功能障礙相關(guān)的病理生理信息。

在眾多疾病研究中，癌癥因其高發(fā)病率備受人們關(guān)注，較早的研究就發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)域的超微弱發(fā)光強(qiáng)度明顯高于正常組織區(qū)域[51-52]，后續(xù)研究表明，是由于腫瘤區(qū)域活性氧含量高[21]導(dǎo)致。此外，在超微弱發(fā)光技術(shù)用于糖尿病的研究中，II型糖尿病患者由于血清抗氧化酶活性下降，從而降低了清除自由基的能力，機(jī)體內(nèi)氧自由基增多[53]，所以糖尿病患者的血清超微弱發(fā)光強(qiáng)度高于健康人[54-55]。同時，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病機(jī)制研究中，生物超微弱發(fā)光技術(shù)也因其可對活性氧(ROS)水平升高進(jìn)行監(jiān)測的潛力而受到關(guān)注。在相關(guān)研究中，利用II型膠原和脂多糖反復(fù)共給藥誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎，在小鼠被引發(fā)關(guān)節(jié)炎的前爪和后爪部位，氧化產(chǎn)物升高而抗氧化劑減少[40,56]，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，超微弱發(fā)光強(qiáng)度較空白對照組高[57-58]，該技術(shù)可能對未來人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病變部位研究提供幫助。

以上實驗研究均表明，超微弱發(fā)光技術(shù)可以對氧化新陳代謝和活組織的氧化損傷進(jìn)行非侵入性監(jiān)測，提示該技術(shù)可為疾病診斷提供依據(jù)，在相關(guān)疾病的早期診斷、疾病發(fā)展以及治療過程中，都表現(xiàn)出巨大潛力。

5 展望

綜上所述，生物超微弱發(fā)光是自然界的一種普遍現(xiàn)象，由于超微弱發(fā)光測定具有非破壞性、非侵入性、能提供時空信息，并且相對具有成本效益等優(yōu)勢[20]，所以，在實際應(yīng)用方面體現(xiàn)出越來越重要的價值。但超微弱發(fā)光技術(shù)也存在一些問題，雖然研究表明，生物超微弱發(fā)光確實與生物體內(nèi)活性氧含量有關(guān)聯(lián)，也與生物體體內(nèi)能量代謝過程密切相關(guān)，但是生物超微弱發(fā)光現(xiàn)象的形成機(jī)理仍然有待于進(jìn)一步探究。并且，超微弱發(fā)光檢測仍存在檢測較困難、無特異性、只能整體檢測等缺點。為了克服這些問題，科學(xué)家們也在不斷對超微弱發(fā)光檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，對其檢測機(jī)制進(jìn)行研究，期望超微弱發(fā)光技術(shù)在進(jìn)一步發(fā)展過程中，能應(yīng)用于更多與氧化代謝異常相關(guān)疾病的檢測，也能在其他實際應(yīng)用方面發(fā)揮更重要的作用，創(chuàng)造更大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。