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        鮮竹瀝化學(xué)成分及抗炎活性研究

        2020-02-19 11:03:42譚洋劉良玉游媛姚金龍林凱鵬付輝政羅躍華
        藥品評價 2020年23期
        關(guān)鍵詞:島津藥組培養(yǎng)箱

        譚洋,劉良玉,游媛,姚金龍,林凱鵬,付輝政,,羅躍華*

        1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院,上海 201203;2.江西省藥品檢驗檢測研究院,國家藥監(jiān)局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,南昌 330029;3.江西省藥品檢查員中心,南昌 330029

        鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹Phyllostachys viridiglaucescens(Carr.)A.et C.Riv.、凈竹P.nudaMcClure、毛竹P.edulis(Carr.)J.Houz.及其同屬植物的新鮮桿莖經(jīng)加熱后自然瀝出的液體,煮沸加入適量防腐劑即得,其亦可稱為竹油、竹醋液和竹汁[1,2]。具有清熱化痰的功效,臨床上用于治療肺熱咳嗽痰多、氣喘胸悶、小兒痰熱驚風(fēng)等病癥?!侗静菅芰x》稱之為“痰家之圣劑”。其主要含有愈創(chuàng)木酚、氨基酸、無機元素、酚酸、黃酮、糖類等成分[3-5]。目前,鮮竹瀝執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)為1992年版《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第一冊,該標(biāo)準(zhǔn)項下的檢測項目包括性狀、薄層鑒別和3個理化檢查項[1],標(biāo)準(zhǔn)較低,加之其加工工藝參數(shù)不明確,難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量,鮮竹瀝也是2019年度國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高起草品種。然而,目前對于鮮竹瀝藥效物質(zhì)研究報道較少,已報道的化學(xué)成分主要是通過理化分析確定的大類成分,其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)志物尚不明確,為了制定更加科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及充分挖掘該資源,作者在項目組前期化學(xué)成分研究基礎(chǔ)上[6,7],繼續(xù)利用各種色譜、波譜技術(shù)從鮮竹瀝乙酸乙酯部位中分離鑒定了4個化合物,分別為1、(7S,8S)-5'-甲氧基-2,3,4,9-四羥基-3':7,4':8-二環(huán)氧新木脂素-1'-羧酸甲酯;2、紫菀苷A;3、(+)-ovafolinin B-9′-O-β-D-glucopyranoside;4、苯丙酮 4′-O-茜黃櫻草糖甙。其中化合物1是新化合物,化合物2~4是首次從鮮竹瀝中分離得到的化合物;體外活性檢測表明,化合物1具有抗炎活性,能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α 和IL-6的釋放。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器島津20-AD型高效液相色譜儀(日本島津公司);島津20-AR型半制備色譜儀(日本島津公司);Buchi中壓制備色譜儀(瑞士Buchi公司);EYELA SB-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司);UV-260紫外分光光度儀(日本島津公司);WZZZB旋光儀(上海物理光學(xué)儀器廠);XT5B熔點儀(天津天光光學(xué)儀器有限公司);Bruker DRX-400超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker公司);Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q TOF高分辨質(zhì)譜儀(美國沃特世公司);多功能微孔板檢測儀(BIOTEK,型號:synergy2);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo,型號:Series 8000DH)。

        1.2 試驗材料與試劑水為Milli-Q超純水,CD3OD和DMSO-d6為美國劍橋公司產(chǎn)品,色譜用試劑為色譜純,其他試劑均為分析純。毛竹采自江西銅鼓,經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院余林博士鑒定為禾本科剛竹屬植物毛竹P.edulis(Carr.)J.Houz.的新鮮桿莖。標(biāo)本現(xiàn)存放在江西省藥品檢驗檢測研究院中藥標(biāo)本館。C18填料為日本YMC產(chǎn)品,制備色譜柱為YMC(5 μm,250 mm×20 mm);柱層層析硅膠、薄層硅膠G板(青島海洋化工廠);RAW264.7細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫);LPS試劑(美國Sigma公司);胎牛血清(Gibco公司,批號:2129075RP);DMED高糖培養(yǎng)基(Cytiva公司,批號:AF29561079);NO測試盒(碧云天生物研究所,批號:042318180614);TNF-α(批號:8G319X)和IL-6 ELISA(批號:8G319X)試劑盒為武漢Elabscience公司產(chǎn)品。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 提取和制備方法取新鮮毛竹桿莖(10 t),經(jīng)切斷、開片、加熱干餾、收集等多種工藝得到鮮竹瀝原液,鮮竹瀝原液經(jīng)低溫減壓濃縮至相對密度為1.21,得到鮮竹瀝浸膏。取浸膏,依次用乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行提取,每種溶劑各提取4次,合并每種溶劑提取液。再進(jìn)一步對得到的溶劑提取液進(jìn)行低溫減壓濃縮,得到乙酸乙酯干膏305 g和正丁醇干膏852 g。將乙酸乙酯干膏經(jīng)硅膠柱色譜分離,氯仿-甲醇(10∶1~6∶4)進(jìn)行梯度洗脫,薄層色譜檢視合并得到9個組分Fr.1~Fr.9。Fr.1(111.9 g)通過硅膠柱分離,以氯仿-甲醇(80∶1~20∶1)梯度洗脫,薄層色譜檢視合并得11個組分Fr.1-1~Fr.1-11。Fr.1-9(3.3 g)再經(jīng)過中壓液相制備色譜,以甲醇-水(20∶80~60∶40)梯度洗脫,經(jīng)高效液相色譜檢測合并得到12個組分Fr.1-9-1~Fr.1-9-12。Fr.1-9-2(68.8 mg)經(jīng)反相半制備液相色譜,甲醇-0.02%三氟乙酸(30∶70)(7 mL/min)為流動相,得化合物1(40.6 mg,tR=85.2 min)。Fr.1-9-4(35.2 mg)經(jīng)反相半制備液相色譜,以甲醇-水(25∶78)(7 mL/min)為流動相,得到化合物2(7.5 mg,tR=92.3 min)、3(9.7 mg,tR=110.8 min)和4(4.1 mg,tR=123.4 min)。

        2.2 體外抗炎活性實驗方法將對數(shù)期生長的RAW264.7細(xì)胞(細(xì)胞濃度為5×105個/mL)接種于24孔板中,每孔500 μL,于培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄上清液,試驗分為正常對照組、模型組和鮮竹瀝A給藥組。每組6個復(fù)孔,對照組和模型組均加入10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基,給藥組分別加入藥物終濃度為0.1、1、10 μmol/L的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中孵育4 h后,模型組和給藥組分別加入終濃度為2 μg/mL的LPS溶液,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后,吸取上清,按照試劑盒說明書檢測上清中NO的含量,平行試驗重復(fù)3次。

        將對數(shù)期生長的RAW264.7細(xì)胞(細(xì)胞濃度為5×105個/mL)接種于24孔板中,每孔500 μL,于培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄上清液,試驗分為正常對照組、模型組和鮮竹瀝A給藥組。每組6個復(fù)孔,對照組和模型組均加入無血清培養(yǎng)基,給藥組分別加入藥物終濃度為0.1、1、10 μmol/L的無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中孵育4 h后,模型組和給藥組分別加入終濃度為2 μg/mL的LPS溶液,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后,吸取上清,按ELISA試劑盒說明書步驟檢測上清中TNF-α 和IL-6含量,平行試驗重復(fù)3次。

        2.3 化學(xué)成分鑒定化合物1:白色粉末。mp 166~167 ℃;。紫外光譜(UV)數(shù)據(jù)表明該化合物在甲醇溶液中于279 nm處有最大吸收。紅外光譜(IR)顯示有羥基(3 319 cm-1)和苯環(huán)(1 448 cm-1)的吸收。HR-ESI-Q-TOF-MS質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰(m/z):401.121 4[M+Na]+(計算值為401.120 7),分子式為C18H18O9。

        1H-NMR譜中,顯示了一組AB鄰位偶合系統(tǒng)苯環(huán)質(zhì)子信號δH:7.24(1H,d,J=8.4 Hz),6.73(1H,d,J=8.4 Hz);一組間位偶合苯環(huán)質(zhì)子信號δH:7.34 (2H,brd);兩個甲氧基信號δH:3.89(6H,s);此外,根據(jù)TCOSY譜,1H-NMR譜還顯示一組脂肪族質(zhì)子信號δH:5.00(1H,d,J=6.6 Hz),4.27(1H,m),3.76(1H,dd,J=12.0,3.6 Hz)和3.65(1H,overlap)。13C-NMR譜中,給出了18個碳信號,其中1個酯羰基碳信號δC:168.2;12個苯環(huán)碳信號δC:158.2,154.3,142.1,132.7,129.4,126.8,116.0,108.3,108.2;3個與氧連接的碳信號δC:89.0,74.3,62.1;2個甲氧基碳信號δC:56.9,52.9。通過以上數(shù)據(jù)可以推測化合物1為木脂素類化合物,與文獻(xiàn)[8]所報道的3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-hydroxymethyl-8-methoxy-2,3-dihydrobenzo[1,4]oxine-6-carbaldehyde結(jié)構(gòu)比較,多一個羥基,醛基由羧基甲酯代替。

        在HMBC中(圖1),H-2' (δH7.34)和H-6' (δH7.34)與羰基碳(δC168.2)相關(guān),表明羰基碳連接在C-1' 位。OMe-5'(δH3.89)與C-5'(δC154.3)和OMe-7' (δH3.89)與C-7'(δC168.2)相關(guān)聯(lián),說明2個甲氧基分別位于C-5'和C-7'位。另外,H-7(δH5.00)與C-1(δC129.4),C-2(δC158.2),C-6(δC129.4),C-8(δC89.0)相關(guān),表明C-7與C-1相連。

        根據(jù)H-7和H-8的耦合常數(shù)JH-7,H-8=6.6 Hz,推測H-7和H-8的相對構(gòu)型為反式[9]。在NOESY譜中,H-7與H-9相關(guān),而H-7與H-8無關(guān)聯(lián),說明H-7和H-8所處的位置為反式。在CD譜中,217 nm處可見正Cotton效應(yīng)(Δε217nm=+9.5),273 nm處顯示負(fù)Cotton效應(yīng)(Δε273nm=-7.5),由此確定該化合物7,8位的絕對構(gòu)型為7S,8S[10]。

        綜上所述,化合物1結(jié)構(gòu)鑒定為(7S,8S)-5'-甲氧基-2,3,4,9-四羥基-3':7,4':8-二環(huán)氧新木脂素-1'-羧酸甲酯,結(jié)構(gòu)如圖1所示。具體核磁數(shù)據(jù)見表1。

        表1 化合物1的1H-NMR and 13C-NMR波譜數(shù)據(jù)(600/150 MHz,CD3OD)

        (續(xù)表)

        化合物2:淡黃色粉末(甲醇)。HR-ESI-MS(m/z):453 [M+Na]+,429 [M -H]-,1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:2.51(3H,s,H-8),4.16(1H,d,J=8.0 Hz,木糖-H-1″),4.93(1H,d,J=8.0 Hz,葡萄糖-H-1′),7.17(2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5),7.94(2H,d,J=8.6 Hz,H-2,6);13C-NMR(DMSO-d6,150 MHz)δ:130.7(C-1),130.0(C-2,6),116.1(C-3,5),161.1(C-4),199.0(C-7),30.9(C-8),99.8(C-1′),73.0(C-2′),76.4(C-3′),69.3(C-4′),76.1(C-5′),68.2(C-6′),103.9(C-1″),73.0(C-2″),76.1(C-3″),69.5(C-4″),65.6(C-5″)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道的數(shù)據(jù)基本吻合,所以鑒定化合物2為紫菀苷A。

        化合物3:淡黃色粉末(甲醇)。HR-ESI-MS(m/z):602 [M+Na]+,578[M -H]-,1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:2.35(1H,d,J=7.6 Hz,H-8′),2.41(1H,m,H-8),2.93(1H,d,J=16.7 Hz,H-7′b),3.13(1H,dd,J=16.8,7.6 Hz,H-7′a),3.31(3H,s,3′-OMe),3.71(3H,s,4-OMe),3.70(1H,dd,J=11.2,6.0Hz,H-9b),3.78(3H,s,5′-OMe),3.87(1H,m,H-9′b),3.89(3H,s,2-OMe),3.98(1H,d,J=8.7 Hz,H-9a),4.33(1H,d,J=8.0 Hz,Glc-H-1″),4.46(2H,dd,J=11.8,4.2 Hz,H-9′a),4.79(1H,s,H-7),6.33(1H,s,H-5),6.54(1H,s,H-6′);13C-NMR(CD3OD,150 MHz)δ:125.7(C-1),146.9(C-2),136.8(C-3),147.8(C-4),102.4(C-5),154.1(C-6),31.5(C-7),42.4(C-8),73.6(C-9),127.5(C-1′),124.2 (C-2′),147.5(C-3′),138.4(C-4′),148.6(C-5′),107.5(C-6′),30.3(C-7′),35.7(C-8′),81.5(C-9′),104.8(C-1″),75.5(C-2″),78.2(C-3″),71.4(C-4″),77.8(C-5″),62.5(C-6″),62.1(3-OCH3),56.6(4-OCH3),60.1(3′-OCH3),56.5(3′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道的數(shù)據(jù)基本吻合,所以鑒定化合物3為(+)-ovafolinin B-9′-O-β-D-glucopyranoside。

        化合物4:棕色粉末(甲醇)。HR-ESI-MSm/z:467 [M+Na]+,443 [M-H]-,1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:1.19(3H,t,J=7.8 Hz,H-9),3.04(2H,m,H-8),3.76(1H,m,H-6'b),4.11(1H,dd,J=12.0,2.0 Hz,H-6'a),4.33(1H,d,J=8.0 Hz,木糖-H-1''),4.98(1H,d,J=8.0 Hz,葡萄糖-H-1'),7.21(2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5),7.99(2H,d,J=8.6 Hz,H-2,6);13C-NMR(CD3OD,150 MHz)δ:132.4(C-1),131.4(C-2),117.3(C-3),162.7(C-4),117.3(C-5),131.4(C-6),202.1(C-7),32.4(C-8),8.7(C-9),101.5(C-1′),74.8(C-2′),77.7(C-3′),71.4(C-4′),77.8(C-5′),69.8(C-6′),105.4(C-1″),75.1(C-2″),77.9(C-3″),71.3(C-4″),66.8(C-5″)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道的數(shù)據(jù)基本吻合,所以鑒定化合物4為苯丙酮 4′-O-茜黃櫻草糖甙。

        2.4 抗炎活性藥理活性測試發(fā)現(xiàn),與正常對照組比較,LPS顯著增加RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α和IL-6的釋放,均具有顯著性差異(P<0.001)(見表2)。化合物1能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α 和IL-6的釋放;其他化合物均無顯著的抗炎活性。

        表2 化合物1對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響(,n=6)

        表2 化合物1對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響(,n=6)

        注:與正常對照組比較,***P<0.001;與模型組比較,#P<0.05、##P<0.01,###P<0.001。

        3 討論

        鮮竹瀝是具有傳統(tǒng)工藝炮制(火炙法)特色的一味止咳祛痰中藥,療效確切。本課題組對鮮竹瀝化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)性研究,首次從鮮竹瀝中獲得2個木質(zhì)素類化合物和2個酚糖苷類化合物,其中化合物1為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物,且具有良好的抗炎活性,能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α 和IL-6的釋放,為闡明鮮竹瀝鎮(zhèn)咳祛痰藥效奠定了物質(zhì)基礎(chǔ),同時為鮮竹瀝進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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