周子濤

遼寧省錦州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，遼寧錦州121004

1 涂片鏡檢

無菌采集病雞鼻腔、眶下竇分泌物并抹片，依次做革蘭染色、瑞氏染色，通過顯微鏡放大觀察，能夠發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性短桿菌的存在，這些細菌一般是單個排列、散亂排列或者是成對排列，其間還存有卵圓形球狀菌體，但是并沒有任何莢膜和芽孢，用美藍染色時表現(xiàn)為兩極濃染[1]。

2 細菌分離培養(yǎng)

操作過程必須做到無菌，把蘸取分泌物的棉拭子直接在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線接種，通過燭缸置于37 ℃的條件下培養(yǎng)2 d。通過試驗可以觀察到該菌落外部呈現(xiàn)灰白色狀態(tài)，且并不粗糙，略微顯得凸起且并不完全透明，該菌落的半徑為0.25～0.50 mm，不與血清相溶，于普通的液體瓊脂培養(yǎng)基上基本不會生長。因此，該菌對糖類等生化反應(yīng)的程度并不強[2]。

3 血清學(xué)試驗

3.1 平板凝集試驗

抽取患病雞群的血液進行分離處理，獲得血清，分別抽取0.05 mL 的A、B、C 3 種血清型的標準抗原滴在試驗用的干凈平板上，然后滴加等量的樣品血清，設(shè)置試驗空白對照組以及陰性和陽性對照組。加入樣品時，應(yīng)該充分攪勻，確保二者能夠完全結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，靜止3～5 min 后觀察凝集結(jié)果，沒有出現(xiàn)凝集的就可以判定為陰性，反之，則判定為陽性。

3.2 血凝抑制試驗（鑒定血清型）

培養(yǎng)菌落從而制備抗原，按規(guī)定方法進行血凝抑制試驗，能使紅細胞完全凝集抑制的血清最高稀釋度即為該型血清的HI 效價。如果被檢抗原與一個以上型的陽性血清有凝集抑制，其與某型陽性血清的HI 效價最高，即判定該抗原為該血清型。

3.3 血凝抑制試驗（檢測副雞嗜血桿菌抗體）

稀釋待檢血清，室溫下作用4 h 或4 ℃低溫過夜，中間充分振蕩，然后離心，取上清。用NaCl 溶液對潔凈的血凝板中第2 個孔位進行稀釋，將每個孔內(nèi)的樣品和對照品按照高倍向低倍度進行稀釋，試驗設(shè)計的稀釋濃度為2～5 倍。血清孔中加入稀釋好的抗原，充分振蕩，于室溫下作用20～30 min 或者37 ℃靜置20 min。每孔加入1%醛化紅細胞，充分振蕩，于室溫下作用40～60 min 或者37 ℃靜置40 min。

4 動物接種試驗

選取5 只動物樣品，將細菌注入樣品的眼痘中，經(jīng)過2 d 后觀察動物出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，一般會出現(xiàn)鼻炎的病癥。

5 藥敏試驗

從病雞中提取到細菌，并將其轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上，分別采用磺胺嘧啶、磺胺米隆以及新諾明等磺胺類藥物和氟苯尼考、羅紅霉素、土霉素、新霉素等廣譜抗菌藥物試紙片進行測試，最后通過觀察試驗結(jié)果，選定發(fā)生敏感反應(yīng)的特效治療藥物[3]。

6 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（I-ELISA）

將抗原用包被液稀釋至工作濃度，加入酶標板各孔中，置4 ℃冰箱過夜。洗板，加入稀釋血清，設(shè)置陰性、陽性對照組及空白對照組，37 ℃溫箱中作用30 min。洗板，加入酶標抗體，37 ℃溫箱中作用30 min。洗板，加入底物液，室溫避光反應(yīng)10～15 min，加入終止液，放入酶標儀讀數(shù)。

7 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)

無菌蘸取病雞眶下竇中黏液或者漿液，浸入生理鹽水，室溫放置0.5 h 后用棉拭子將管壁上的液體盡量擠干，然后丟棄至消毒液缸內(nèi)。離心，棄去大部分上清液，加入滅菌去離子水，煮沸再冰浴后再次離心，取出上清作為PCR 樣品。經(jīng)過3 個階段的PCR 擴增，用1%瓊脂糖膠檢測擴增產(chǎn)物。