王珂佳1,2,3,邱樹毅

(1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學院輕工化工系,貴州貴陽 550025; 2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025; 3.貴州大學生命科學學院,貴州貴陽 550025; 4.貴州大學釀酒與食品工學院,貴州貴陽 550025)

微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。在食品、醫(yī)藥、環(huán)保等諸多領(lǐng)域,菌種質(zhì)量優(yōu)劣直接決定了其發(fā)酵過程成敗和發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的高低。目前,常用的微生物菌種選育方法主要有以自然選育、誘變育種、雜交育種為代表的傳統(tǒng)育種[1]和以原生質(zhì)體融合、基因組重排技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等為代表的基因工程育種[2-4]。傳統(tǒng)育種因不用掌握微生物及其次生代謝產(chǎn)物的遺傳信息而操作簡單,但育種時間長,工作量大,突變效率低[5];利用基因技術(shù)雖然能夠以定向和組合方式在目的菌種特定基因組位置上進行修飾[6],但因需對目的菌種的基因信息全面準確掌握,在一定程度上限制了基因工程育種技術(shù)的應(yīng)用推廣[1]。

20世紀90年代末期,基于傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細胞融合技術(shù)的基因組重排(genome shuffling)概念首次被提出[7],2002年,Zhang等[8]以傳統(tǒng)誘變方法獲得的多種正突變子為出發(fā)菌株,通過多輪遞推原生質(zhì)體融合使基因組隨機重排篩選出性狀最優(yōu)的后代菌株?；蚪M重排技術(shù)具有操作簡單、突變效率高和適用性強等特點,是一種新型的微生物菌種選育方法,同時,因為重排后的菌株不被認為是轉(zhuǎn)基因生物,所以該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)[9]。本文對近年來基因組重排技術(shù)在微生物育種領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展進行了詳細闡述。

1 基因組重排技術(shù)的原理

基因組重排技術(shù)是一種基于誘變技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)相結(jié)合經(jīng)改良的菌株選育技術(shù)。常規(guī)原生質(zhì)體融合技術(shù)是指兩個細胞之間融合的過程具有不同的遺傳特性,并結(jié)合雙親的遺傳特性獲得穩(wěn)定的重組體。在原生質(zhì)體融合過程中,每代只有兩個親本產(chǎn)生重組?；蚪M重排技術(shù)雖然起源于原生質(zhì)體融合,但是與原生質(zhì)體融合相比,基因組重排技術(shù)允許經(jīng)誘變技術(shù)處理產(chǎn)生的多個正突變菌種之間進行重組,并且通過幾輪遞歸基因組融合,導致最終改進的菌株涉及來自多個正突變菌株的遺傳性狀,極大增加了“復雜后代”的遺傳多樣性,并顯著提高獲得高性能菌株的機會[10]。

2 基因組重排育種操作過程

采用基因組重排技術(shù)對微生物菌種進行選育主要包括構(gòu)建有效親本文庫,制備原生質(zhì)體,遞歸原生質(zhì)體融合和篩選優(yōu)質(zhì)突變菌株等步驟[11]。

2.1 誘導構(gòu)建有效親本文庫

構(gòu)建具有強效菌株的有效親本文庫是基因組重排的第一步。在構(gòu)建親本文庫時,初始微生物群體必須具有良好的遺傳多樣性和足夠的表型變異,然后使用甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和甲基磺酸乙酯(Ethyl methylsulfonate,EMS)等化學誘變劑[9]或紫外線、輻射等物理誘變劑[11]對菌株進行單輪或數(shù)輪誘變。有時,為了使菌株產(chǎn)生更高水平的多樣性,也可以組合使用誘變劑[12]。近年來有研究表明,常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)中的活性粒子可以有效造成微生物DNA多樣性的損傷,且突變率高,獲得的突變株遺傳性狀穩(wěn)定,是一種操作簡便,經(jīng)濟性好的誘變技術(shù)[13]。最后,性狀表現(xiàn)最佳的菌株被鑒定為遞歸原生質(zhì)體融合的下一步的親本。

2.2 原生質(zhì)體制備

原生質(zhì)體是根據(jù)微生物的類型,運用適合的溶酶體,裂解酶或其他細胞消化酶消化剝離細胞壁來釋放原生質(zhì)體[11]。原生質(zhì)體制備作為一個酶解過程,酶的性質(zhì)、用量、酶解時間、溫度和pH等都是制備高質(zhì)量原生質(zhì)體的影響因素[14]。汪軍玲等[15]研究發(fā)現(xiàn)菌齡5 d的1%纖維素酶比果膠酶和溶壁酶更有利于北冬蟲夏草原生質(zhì)體的形成和釋放,且最優(yōu)酶解時間為2 h。Inoue等[16]在35 ℃下利用海藻酸裂解酶和β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶可高效制備日本海帶原生質(zhì)體,最適pH分別為8.7和5.9。陳建中[17]選擇培養(yǎng)60 h的草菇菌絲,在溶壁酶濃度1.5%,32 ℃條件下酶解3 h,以0.6 mol/L甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑有效制備了草菇原生質(zhì)體。通過選擇適合的酶,優(yōu)化酶的用量、酶解時間、溫度和pH等因素可以有效制備高質(zhì)量原生質(zhì)體。

2.3 遞歸原生質(zhì)體融合

遞歸原生質(zhì)體融合是基因組重排的關(guān)鍵步驟,通過突破種屬間界限來擴大基因組重排的范疇和多樣性。首先,將通過酶解微生物細胞所獲得的原生質(zhì)體進行離心收集,然后,通過電脈沖或硝酸鹽、聚乙二醇等化學試劑[10]改善膜的流動性來實現(xiàn)原生質(zhì)體融合,劉紅全等[18]通過對經(jīng)誘變處理的擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)進行兩輪遞歸式原生質(zhì)體融合,篩選到遺傳穩(wěn)定、脂肪酸產(chǎn)量提高的改組藻株。胡向東等[19]經(jīng)過4輪原生質(zhì)體遞歸融合從綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridoehrongenes2-21)突變株中篩選出1株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)阿維拉霉素重組菌株H4-15。近年來,光學鑷子[20]、飛秒激光[21]和微流體芯片[22]等新技術(shù)也被應(yīng)用于原生質(zhì)體融合。最后,在融合結(jié)束時將獲得的原生質(zhì)融合體離心,洗滌,重懸于緩沖液中,連續(xù)稀釋并在再生培養(yǎng)基上再生獲得的菌株并進行下一輪融合,重復幾輪直至獲得所需的菌株[9]。原生質(zhì)體融合的效率受工藝條件的影響,因此,在進行原生質(zhì)體融合之前,需要優(yōu)化融合條件,以確保高效率的原生質(zhì)體融合和再生[23]。嚴寒靜等[24]在研究廣藿香原生質(zhì)體制備中以40% PEG 6000化學促融30 min、加入0.5倍體積的融合液、細胞密度2.0×105個·mL-1的條件進行原生質(zhì)體融合,融合率可達57.19%;李亮等[25]采用基因組重排法選育高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌株時,發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體融合最佳條件為30% PEG,0.03 mol·L-1Ca2+,30 ℃融合12 min,原生質(zhì)體融合率提升1.95%,說明通過優(yōu)化融合條件,可有效提高原生質(zhì)體的融合率。

2.4 優(yōu)質(zhì)突變菌株篩選

建立一種高通量的篩選優(yōu)質(zhì)突變菌株的方法是保障基因組重排成功育種的關(guān)鍵。在篩選改善脅迫耐受性或底物利用菌株時,常用的篩選方法主要有維多利亞藍板測定(Victoria Blue Plate Assay)[26],含有氯化鈉的酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(Yeast extract peptone dextrose media containing sodium chloride)[27]和含有木糖,乙醇和瓊脂的選擇性培養(yǎng)基(Selective media containing xylose,ethanol and agar)[23]等的篩選方法,通過觀察培養(yǎng)基上菌株的透明區(qū),水解區(qū)和抑制區(qū)等生長特征來評估性狀。另外,篩選能提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的菌株,主要應(yīng)用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)[13]、熒光定量(Fluorescent quantitation)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)[28]和毛細管區(qū)帶電泳(Capillary zone electrophoresis)[29]等基于生長的高通量篩選方法。篩選出的突變菌株,還需通過性能和遺傳穩(wěn)定性等方面的綜合評價,才能被確定為滿足工業(yè)生產(chǎn)需要的改良菌種[30]。胡向東等[19]以利福平為篩選劑,通過基因組重排,從綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridoehrongenes2-21)中篩選出1株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)阿維拉霉素重組菌株H4-15。趙晨等[31]以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)轉(zhuǎn)酮酶缺陷變異株為出發(fā)菌株,通過反向篩選標記法構(gòu)建獲得一株具有正反向篩選標記的菌株,再經(jīng)基因組重排篩選高抗逆性D-核糖高產(chǎn)菌株。宋佳雯等[32]通過基因組重排,經(jīng)過96孔板發(fā)酵高通量篩選和搖瓶發(fā)酵復篩驗證,獲得了一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase)達7.12 U/mL的茂源鏈霉菌。趙俊杰等[33]利用巴龍霉素抗性篩選和基因組重排技術(shù)選育出一株ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株。目前,基因組重排技術(shù)已被有效應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)突變菌株篩選。

3 基因組重排技術(shù)在微生物菌種選育中的應(yīng)用

基因組重排技術(shù)是一種快速有效定向進化細胞基因組的方法,在微生物領(lǐng)域,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)改良菌株,在增加次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量、增強菌株耐受性和提高底物利用能力等方面具有顯著作用。

3.1 基因組重排技術(shù)增加微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量

微生物是生產(chǎn)氨基酸、抗生素、抗腫瘤化合物、免疫抑制劑、抗病毒劑、抗寄生蟲藥和酶制劑等生物制品的重要來源。大多數(shù)生物制品的性狀表型是依賴于遺傳水平上的多個協(xié)調(diào)變化而產(chǎn)生的,通過傳統(tǒng)的隨機誘變方法改良基因表型需要篩選大量復雜的基因組合文庫,才能成功分離出所需表型?；蚪M重排技術(shù)是一種快速改進微生物菌株表型的方法。Zhang等[8]首次利用該技術(shù)改良泰樂菌素產(chǎn)生菌,結(jié)果表明僅在2輪基因組改組后便獲得了顯著的表型改善,而傳統(tǒng)誘變篩選則需要20多年的時間。目前,基因組重排技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于細菌、霉菌、酵母菌和放線菌等多種微生物菌種改良以獲得高產(chǎn)量的生物制品。

在改組細菌研究方面,Zhang等[34]利用基因組重排方法,構(gòu)建了一株高產(chǎn)γ-聚谷氨酸(γ-gamma-PGA,γ-PGA)的耐葡萄糖枯草芽孢桿菌菌株(High glucose tolerant Bacillus subtilis)。首先通過紫外誘變對母本枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)W14株進行定向進化,然后進行三輪基因組重排,最終篩選出一株高性能枯草芽孢桿菌C2。該菌株生長48 h后能產(chǎn)生(45.6±0.7) g/L的γ-聚谷氨酸(γ-PGA),比母體W14菌株提高了3.5倍;菌體濃度比母體W14菌株提高了2.3倍,達到(15.3±0.5) g/L。SHI等[35]利用基因組重排原理對淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)LZ-5產(chǎn)脂肽類抗生素性狀進行了改良,經(jīng)過兩次基因組重排,獲得了一株179.22 mg/L的伊枯草菌素A(iturin A)高產(chǎn)菌株,比野生菌株增產(chǎn)2.03倍。Zhao等[36]利用基因組重排技術(shù),經(jīng)過兩輪基因組重排提高了淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)ES-2-4產(chǎn)泛革素(Fengycin)能力,獲得一株高產(chǎn)重組FMB72菌株,產(chǎn)量增加了8.30倍。

在改組酵母菌研究方面,Yin等[12]應(yīng)用基因組重排技術(shù)提高了釀酒酵母YS86產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量,經(jīng)過2輪基因組重排獲得了一株高產(chǎn)重組YSF2-19菌株,其谷胱甘肽的產(chǎn)量32倍。為提高阿拉伯糖醇的生產(chǎn)能力,Kordowska等[37]對假絲酵母(Candida parapsilosis)進行基因組重排育種研究,初始菌株通過紫外輻射誘變,經(jīng)二輪基因組重排篩選出兩種融合子GSII-3和GSII-16,兩種融合子在選擇培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的阿拉伯糖醇濃度比野生型菌株高50%,均能產(chǎn)生11.83 g/L和11.75 g/L的阿拉伯糖醇,且比野生型菌株的效率高出15%～16%,且經(jīng)測定新菌株的倍性沒有改變,說明基因組重排技術(shù)具有遺傳安全性。

在改組霉菌研究方面,El-gendy等[28]在對海洋紅樹林源真菌進行洛伐他汀產(chǎn)量篩選時,以米糠固態(tài)發(fā)酵(solid state fermentation,SSF)的方式,以盧氏曲霉(Aspergillusluchuensis)MERV10為親本菌株,通過誘導突變和連續(xù)3輪基因組重排,優(yōu)化米糠固態(tài)發(fā)酵(SSF)因子,使洛伐他汀(Lovastatin)的產(chǎn)量提高了32倍。Wang等[38]利用基因組重排技術(shù),利用特異性原生質(zhì)體融合技術(shù)成功培育出具有高果糖轉(zhuǎn)移酶(FTase)活性的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株,其果糖轉(zhuǎn)移酶(FTase)活性約為原菌株的2倍。

在改組放線菌研究方面,Wang等[30]結(jié)合基因組重排和慶大霉素抵抗來提高了蛋白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)W-156中的多聚賴氨酸(Epsilon-poly-l-lysine,epsilon-PL)的產(chǎn)量。Yu等[39]采用基因組重排和核糖體工程相結(jié)合的方法,獲得了玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)的PRGN21突變體,該菌株產(chǎn)生的達托霉素產(chǎn)量接近324 mg/L,是親本菌株產(chǎn)量的4倍。Tong 等利用基因組重排技術(shù)對弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomycesvirginiae)進行改良,經(jīng)過5輪基因組重排,獲得了一株基因穩(wěn)定的菌株G5-103,其特征是能產(chǎn)生251 mg/L的威里霉素(Virginiamycin),是野生株的11.6倍[40]。

綜上所述,基因組重排技術(shù)在改進細菌、酵母菌、霉菌和放線菌等微生物菌株表型上具有顯著效果。

3.2 基因組重排技術(shù)增強微生物對環(huán)境耐受性

微生物對環(huán)境耐受性主要包括對代謝產(chǎn)物、底物、副產(chǎn)物的耐受性和對溫度、pH和溶劑等工藝環(huán)境因素的耐受性。由于微生物的許多耐受表型是多基因相互協(xié)同作用的結(jié)果,因此,對于其環(huán)境耐受性的研究是一個復雜且困難的過程。近年來,相關(guān)研究表明,基因組重排技術(shù)在改善微生物的環(huán)境耐受性方面表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。

在生物乙醇發(fā)酵的最后階段,高濃度的乙醇會導致酵母細胞發(fā)酵緩慢或停滯,并限制乙醇的生產(chǎn),因此在現(xiàn)代生物乙醇生產(chǎn)工藝中要求釀酒酵母具有耐熱性、滲透性和對次生代謝產(chǎn)物的抗性增強等特點[41],但迄今為止,在自然界中還沒有發(fā)現(xiàn)具有上述所有特征的菌株。近年來,開發(fā)具有良好乙醇耐受性的新型釀酒酵母菌株提高產(chǎn)量和效率成為了研究的熱點。Snoek等[42]基于基因組重排原理,通過幾輪機器人輔助的靶向基因組重排,選育出的耐乙醇雜交釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種表現(xiàn)出較高的耐乙醇性和產(chǎn)量。Wei等[43]基于基因組重排技術(shù)建立了一種提高醋酸細菌(Acetic acid bacterium)乙醇耐受性的方法。以野生型醋酸菌為材料,經(jīng)誘變處理后,通過3輪基因組重排篩選出一株耐乙醇菌株,該菌株可以在含13%乙醇的液體培養(yǎng)基中生長。De gerando等[44]采用隨機誘變和基因組重排技術(shù),提高了厭氧拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)DSM 6423對異丙醇的耐受性,突變菌株對異丙醇的耐受濃度高達50 g/L。酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量乙醛會影響產(chǎn)品質(zhì)量。

亞硫酸鹽廢液(Spent sulfite liquor,SSL)是亞硫酸鹽制漿過程中產(chǎn)生的一種廢液,其中含有可發(fā)酵成乙醇的單糖。然而,釀酒酵母會受到亞硫酸鹽廢液(SSL)中抑制物質(zhì)的影響,降低乙醇產(chǎn)率。為了克服這一局限性,Pinel 等[45-46]采用基于大規(guī)模群體雜交的基因組重排技術(shù)對釀酒酵母進行了定向進化改造,使其對硬木亞硫酸鹽廢液(Hardwood spent sulfite liquor,HWSSL)具有比野生型更強的耐受性。通過紫外光誘導釀酒酵母突變,經(jīng)過5輪基因組重排,分離出3株能夠在未稀釋的硬木亞硫酸鹽廢液(HWSSL)上生長的菌株,并能利用其中的單糖高效生產(chǎn)乙醇。Bajwa等[47]為了提高畢赤酵母對硬木亞硫酸鹽廢液(HWSSL)的耐受性,采用紫外光誘導起始菌株,進行4輪基因組重排后獲得4個突變株,其對硬木亞硫酸鹽廢液(HWSSL)的耐受性提高至80%(v/v)以上,而起始菌株則在65%(v/v)或更低。

3.3 基因組重排技術(shù)提高微生物對底物的吸收利用能力

有效利用發(fā)酵底物也是微生物的一個重要表型特征,通過基因組重排技術(shù)可以提高微生物利用底物的能力。Kang等[48]利用基因組重排技術(shù)對出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)N3.387進行改良,經(jīng)3輪基因組重排后獲得的突變體F3-2的原料利用率為97.9%,比野生型菌株高29.0%。2012年,Ge等[49]利用基因組重排改良釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),經(jīng)過3輪基因組重排,獲得了一株發(fā)酵木糖和葡萄糖的基因穩(wěn)定、產(chǎn)乙醇高的菌株。該菌種發(fā)酵84h后,產(chǎn)乙醇26.65 g/L,比釀酒酵母W5(18.12 g/L)產(chǎn)乙醇高47.08%。木糖和葡萄糖的利用率分別為69.48%和100%,而W5的利用率分別為14.83%和100%。Ren等[50]采用基因組重排技術(shù),結(jié)合耐高溫釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和念珠菌(Candidaintermedia)中間體23的葡萄糖-乙醇和木糖-單細胞蛋白的優(yōu)良特性,構(gòu)建了釀酒酵母重組菌株14。以NaOH預(yù)處理和玉米秸稈為原料,采用補料分批發(fā)酵工藝生產(chǎn)乙醇和單細胞蛋白,為農(nóng)業(yè)生物質(zhì)中己糖和戊糖的綜合利用提供了可能的途徑。Inokuma等[51]利用抗藥性標記輔助基因組重排技術(shù)建立了一種利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株在高溫和酸性共脅迫下提高木糖發(fā)酵能力的方法,提升了釀酒酵母利用木糖發(fā)酵的能力。與親本菌株相比,雜交菌株在熱、酸共脅迫條件下均表現(xiàn)出較高的木糖發(fā)酵能力。Demeke等[52]利用基因組重排技術(shù),將木糖代謝途徑結(jié)合到工業(yè)酵母菌株乙醇紅(Ethanol red)中開發(fā)出一種能利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物生產(chǎn)生物乙醇的菌株。

4 展望

基因組重排技術(shù)(genome shuffling)自1998年首次提出以來,已成功應(yīng)用于大量細菌、霉菌、酵母菌和放線菌等具有不同工業(yè)價值的微生物菌種選育,為微生物性狀改造提供了一條高效、簡便、省時省力的途徑。近年來,雖然對基因組重排技術(shù)進行了廣泛研究,但該技術(shù)還存在以下幾個方面的問題。第一,構(gòu)建有效親本文庫是基因組重排的第一步,目前常用的構(gòu)建方式多數(shù)是傳統(tǒng)的化學誘變和物理誘變。但是傳統(tǒng)誘變技術(shù)存在突變方向和性質(zhì)不能控制,正向變異少,須大量材料等缺點。雖然近年有文獻報道常壓室溫等離子體(ARTP)[53-55]因其價廉簡便、突變率高、環(huán)境友好等特點被用于菌種誘變,但常壓室溫等離子體(ARTP)誘變機制還未闡明[56],突變方向難以控制的局限性也未能突破。因此在構(gòu)建有效親本文庫技術(shù)上還需要進一步的研究。第二,基因組重排的關(guān)鍵步驟是實現(xiàn)原生質(zhì)體有效融合,雖然光學鑷子[20]、飛秒激光[21]和微流體芯片[22]等新技術(shù)的出現(xiàn),實現(xiàn)了原生質(zhì)體的高效融合,但上述技術(shù)作為新興技術(shù)自身還存在一定缺陷,其穩(wěn)定性、有效性和適用性還需要提高。第三,利用基因組重排技術(shù)改良菌株實現(xiàn)增加次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量、增強菌株耐受性和提高底物利用能力等方面的研究還處于定性定量階段,對于產(chǎn)生上述效果的作用機制研究還不夠深入。第四,篩選優(yōu)質(zhì)突變菌株是基因組重排的最終目的?；蚪M重排后快速有效地從大量融合體中鑒定所需表型是非常困難的,需要建立一種能廣泛應(yīng)用的高通量篩選方法。

隨著代謝組學、蛋白組學、基因編輯技術(shù)和生物信息學等現(xiàn)代生物工程理論和技術(shù)的蓬勃發(fā)展,有利于結(jié)合相關(guān)理論和技術(shù)改良優(yōu)化基因組重排技術(shù),提高其在微生物菌種選育方面的應(yīng)用效率,為食品、醫(yī)藥、環(huán)保等產(chǎn)業(yè)培育出更多高效優(yōu)質(zhì)功能菌種。