莊元 ，譚俊 ，伍瓊芳

(1.江西省婦幼保健院生殖健康科；2.江西省婦幼保健院輔助生殖中心，南昌 330006)

隨著國(guó)家二胎政策的深化落實(shí)，輔助生殖技術(shù)為不能自然受孕的夫婦提供了科學(xué)有效的助孕措施[1]。對(duì)于進(jìn)行IVF-ET（體外受精-胚胎移植）和ICSI(卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射)的患者，獲得良好的胚胎是成功受孕的先決條件[2]。而在實(shí)際的臨床工作中，往往出現(xiàn)一些異常受精胚胎，如1PN胚胎、0PN(2PB)胚胎、多原核胚胎和發(fā)育停滯的 2PN胚胎作為廢棄胚胎被銷毀，實(shí)際上，有一定比例的廢棄胚胎繼續(xù)培養(yǎng)仍可發(fā)育成正常的囊胚，最終可獲得妊娠[3]。

c-kit是一種在卵子發(fā)生中起重要作用的原癌基因，其配體干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)是一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，通過(guò)與c-kit受體特異性結(jié)合后可誘導(dǎo)其磷酸化，激活多種蛋白激酶和信號(hào)通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SCF處理后家貓卵泡顯著生長(zhǎng)[4]。相反，SCF/c-kit信號(hào)的抑制會(huì)干擾卵母細(xì)胞的發(fā)育、初級(jí)卵泡的生長(zhǎng)、腔前卵泡的形成和成熟卵泡的排卵[5,6]。在小鼠早期胚胎表面亦證明c-kit受體的表達(dá)[7]，而且，體外培養(yǎng)早期鼠胚給予SCF后，能明顯促進(jìn)胚胎的分裂和增殖，提高囊胚形成率[8]，提示該信號(hào)通路在小鼠胚胎早期分裂增殖過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。然而，c-kit受體是否在人胚胎早期發(fā)育過(guò)程表達(dá)、其信號(hào)功能與胚胎質(zhì)量的關(guān)系等研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此我們通過(guò)對(duì)廢棄胚胎進(jìn)行免疫熒光染色，觀察c-kit受體在人胚中的表達(dá)情況，并對(duì)廢棄胚胎進(jìn)行干預(yù)性囊胚培養(yǎng)，探討SCF/c-kit對(duì)囊胚發(fā)育的潛在作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月-2018年6月于江西省婦幼保健院輔助生殖中心行IVF-ET（體外受精-胚胎移植）和ICSI(卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射)的3PN胚胎79枚（分別為受精卵期33枚，卵裂期26枚及囊胚期20枚）用于免疫熒光染色，另受精第3天的3PN胚胎167枚，患者年齡均在20-37歲，應(yīng)用早卵泡期超長(zhǎng)方案，選取受精卵第3d，Ⅰ級(jí)Ⅱ級(jí)3原核（3PN）胚胎，6-12卵裂球，對(duì)稱，碎片（5-20）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者了解研究方案并簽署知情同意書。

1.2 試劑 兔抗人c-kit單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)CST公司)，CY3標(biāo)記的鼠抗兔二抗 (購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司)，DAPI染色液 (購(gòu)自中山金橋生物技術(shù)有限公司)，G2.5囊胚培養(yǎng)液 （購(gòu)自瑞典Vitrolife公司），HSA人類血清白蛋白 （購(gòu)自瑞典Vitrolife公司）。

1.3 免疫熒光染色檢測(cè)c-kit受體表達(dá) 將各個(gè)階段的胚胎用用4%多聚甲醛固定30 min,然后用免疫染色洗滌液洗3遍，免疫染色封閉液封閉1h，轉(zhuǎn)入c-kit抗體中，4℃孵育過(guò)夜，洗3遍，與Cy3偶聯(lián)的相應(yīng)二抗在黑暗中于25°C孵育1 h，洗滌3遍，DAPI染色5min，洗3遍，封片，熒光顯微鏡下觀察攝像。

1.4 受精卵的體外囊胚培養(yǎng)

1.4.1 分組與方法 采用G2.5（囊胚培養(yǎng)液）+HSA（人類血清白蛋白）為培養(yǎng)基。根據(jù)隨機(jī)分組原則，將胚胎分為3組，SCF組：G2.5+HSA+SCF（100ng/mL）57例；SCF+Imatinib（伊馬替尼）組：G2.5+HSA+SCF（100ng/mL） +imatinib（10μM）54 例；對(duì)照組：G2.5+HSA+PBS（磷酸緩沖鹽溶液）56例。3組患者一般資料的均衡性較高，具有可比性。

1.4.2 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 選擇第6d囊胚，評(píng)價(jià)囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率 （≥4BC）。Garnder囊胚分級(jí)4級(jí)，擴(kuò)張后囊胚，囊胚強(qiáng)體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大，透明袋變薄。ICM評(píng)分A級(jí)，細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)合緊密；B級(jí)，細(xì)胞數(shù)目較少，結(jié)合較松散。TE評(píng)分A級(jí)，細(xì)胞數(shù)目多，囊胚四周均有細(xì)胞分布；B級(jí)，細(xì)胞數(shù)目較少，上皮細(xì)胞較松散；C級(jí)，細(xì)胞數(shù)目極少。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-kit蛋白的表達(dá) 我們通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)c-kit受體在3PN胚胎上的表達(dá)情況，結(jié)果表明，c-kit受體蛋白在受精卵期（圖1）、卵裂期（圖2）及囊胚期（圖3）的胚胎表面均有表達(dá)。這提示c-kit信號(hào)可能胚胎的發(fā)育緊密相關(guān)。

圖1 免疫熒光檢測(cè)廢棄的人受精卵中c-kit受體表達(dá)情況；藍(lán)色：細(xì)胞核；綠色：c-kit蛋白

圖2 免疫熒光檢測(cè)廢棄的人卵裂期胚胎中c-kit受體表達(dá)情況；藍(lán)色：細(xì)胞核；綠色：c-kit蛋白

圖3 免疫熒光檢測(cè)廢棄的人囊胚中c-kit受體表達(dá)情況；藍(lán)色：細(xì)胞核；綠色：c-kit蛋白

2.2 胚胎囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率比較 與SCF+Imatinib組和對(duì)照組相比，SCF組囊胚形成率更高（SCF組：38.6%，SCSCF+Imatinib組：22.22%， 對(duì)照組：25%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值＜0.05）；SCF 組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率15.79%，SCF+Imatinib組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率5.56%，對(duì)照組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率8.93%，SCF組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率明顯高于SCF+Imatinib組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。(見表1)

表1 3組囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率比較

3 討論

近年研究表明，胚胎在早期發(fā)育過(guò)程中表面表達(dá)受體的缺失或功能異?？捎绊懪咛セ虻谋硇?，甚或?qū)е屡咛グl(fā)育異常[9,10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胚胎體外培養(yǎng)時(shí)加入部分酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinases，RTKs）家族的激動(dòng)劑或配體，可明顯提高胚胎的細(xì)胞分裂增殖能力，改善胚胎質(zhì)量[11]；而抑制這些受體功能，則出現(xiàn)卵裂球細(xì)胞分裂能力減弱、碎片增多以及胚胎發(fā)育停滯甚至退化等病理改變[12]。上述結(jié)果表明RTKs與胚胎早期發(fā)育密切相關(guān)[13]。

由c-kit基因編碼的C-KIT受體亦屬于III型RTK家族成員,與干細(xì)胞因子結(jié)合通過(guò)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,參與機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)重要事件的調(diào)控[14]。有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)早期鼠胚給予SCF后，能明顯促進(jìn)胚胎的分裂和增殖，提高囊胚形成率[8]，提示該信號(hào)通路在小鼠胚胎早期分裂增殖過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。然而，c-kit受體是否在人胚胎早期發(fā)育過(guò)程表達(dá)，SCF是否能促進(jìn)人胚胎的分裂和增殖，提高囊胚形成率等研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

我們對(duì)體外受精治療過(guò)程中各階段的廢棄人胚進(jìn)行c-kit受體檢測(cè)，免疫熒光結(jié)果均顯示：ckit受體表達(dá)于移植前人胚的各個(gè)階段，即受精卵期，卵裂期及囊胚期（見圖1,2,3）。提示c-kit信號(hào)很可能與人胚的早期發(fā)育密切相關(guān)。

我們將3PN胚胎分組培養(yǎng)，分別置于G2.5+HSA+SCF/Imatinib+SCF/PBS中培養(yǎng)，進(jìn)行比較研究。其中添加Imatinib組為受體抑制劑組，研究結(jié)果顯示，SCF組不論囊胚形成率（38.60%），還是優(yōu)質(zhì)囊胚形成率（15.79%），均明顯高于SCF+Imatinib組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05、P＜0.001)。表明SCF/c-kit能促進(jìn)移植前胚胎形成優(yōu)質(zhì)囊胚。

已有不少報(bào)道指出，有相當(dāng)一部分的不孕癥患者移植 1PN胚胎及 0PN(2PB)胚胎后，可生育出健康的子代。如果某些患者在輔助生殖治療中僅剩下3PN胚胎，且不愿意放棄移植，是否可通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)方式提高優(yōu)質(zhì)囊胚形成并結(jié)合移植前染色體檢測(cè)技術(shù)，為患者提供有移植價(jià)值的胚胎，還需進(jìn)一步探索[15]。

綜上所述，SCF/c-kit可促進(jìn)體外受精中3PN胚胎囊胚的形成。本研究?jī)H對(duì)SCF/c-kit在囊胚發(fā)育中的作用做了實(shí)驗(yàn)分析，但其對(duì)臨床妊娠率的影響作用尚需進(jìn)一步研究探討。