張連富，方興根，李子付

(1.安徽省第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，合肥 230041；2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院神經(jīng)外科，蕪湖 241001；3.海軍大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200433）

神經(jīng)外科且破裂出血后梭形動(dòng)脈瘤是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中比較少見，僅占顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的3%-13%[1]。由于其特殊的形態(tài)導(dǎo)致治療難度較大，雖然大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)因素包括：年齡、男性、吸煙、高血壓以及高血糖等[2]。但其形成、生長(zhǎng)和破裂的發(fā)病機(jī)制仍然不是很明確。雖然有學(xué)者指出基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤密切相關(guān)，且可能在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成、發(fā)展及其破裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。國(guó)內(nèi)早期也有細(xì)菌性顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的報(bào)道[4]。但相關(guān)機(jī)制仍缺乏研究。而單獨(dú)針對(duì)顱內(nèi)梭形動(dòng)脈瘤的研究也很少見。本研究主要利用豬胰彈性蛋白酶消化大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈制作梭形動(dòng)脈瘤模型。并作出一些相關(guān)形態(tài)學(xué)和病理學(xué)的分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康SD大鼠40只，體質(zhì)量250-300g，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A、B，每組各10只。

1.2 動(dòng)物模型制備 予術(shù)前12h禁食水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4ml/100g)后，沿頸前正中切口，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，游離出頸總動(dòng)脈，用外科手術(shù)使用無(wú)菌手套制作大小約5×15mm乳膠片，將制作好的乳膠片墊于游離出的頸總動(dòng)脈下，兩端用1號(hào)手術(shù)切口縫合線結(jié)扎形成一凹槽，限定凹槽長(zhǎng)度為10mm，向該凹槽內(nèi)注入來(lái)源于豬的胰彈性蛋白酶 (上海林葉生物科技有限公司)0.25（1.0U/μl），待消化 25min 后，吸干殘留豬胰彈性蛋白酶后松開兩端結(jié)扎線，用生理鹽水反復(fù)沖洗數(shù)次后取出乳膠片，逐層縫合皮膚。對(duì)照組用0.9%氯化鈉溶液代替豬胰彈性蛋白酶，操作步驟同實(shí)驗(yàn)組（圖 1a、b、c、d）。

圖1 1a SD大鼠正常右側(cè)頸總動(dòng)脈；1b乳膠片包裹右側(cè)頸總動(dòng)脈生理鹽水消化中,動(dòng)脈外膜無(wú)明顯變化；1c乳膠片包裹右側(cè)頸總動(dòng)脈豬胰彈性蛋白酶消化中，可見動(dòng)脈外膜逐漸透亮變??；1d大鼠正常右側(cè)頸總動(dòng)脈豬胰彈性蛋白酶消化后，可見動(dòng)脈局部膨脹，血管壁呈暗紅色

1.3 影像學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別在7d、14d行腹主動(dòng)脈數(shù)字減影血管造影（DSA）檢查。術(shù)中取大鼠腹部正中切口，游離出腹主動(dòng)脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端利用動(dòng)脈瘤夾臨時(shí)阻斷，用4F的穿刺鞘插入腹主動(dòng)脈后用1號(hào)線固定穿刺鞘頭端。在微導(dǎo)絲的引導(dǎo)下將微導(dǎo)管行至主動(dòng)脈弓，手推約2ml造影劑碘海醇，顯示右側(cè)頸總動(dòng)脈形態(tài)。使用DSA機(jī)器(Philps Allura Xper FD20)自帶軟件測(cè)量形成的梭形動(dòng)脈瘤長(zhǎng)徑、寬徑以及正常動(dòng)脈直徑（圖2）。

圖2 2a SD大鼠正常頸總動(dòng)脈造影圖像；2b經(jīng)豬胰彈性蛋白酶消化后14d動(dòng)脈造影圖像可見局部梭形突起（箭頭所示）

1.4 組織學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別在7d、14d造影后灌注處死，取出右側(cè)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈瘤標(biāo)本放入4%多聚甲醛固定24h以上，再行石蠟包埋切片行HE染色和彈力纖維染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，方差經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布和方差齊性，組間兩兩比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用簡(jiǎn)單的外科手法結(jié)合豬胰彈性蛋白酶局部消化包裹的大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈壁，術(shù)中可見血管壁逐漸變薄、透亮（圖1c）。豬胰彈性蛋白酶消化25min后解除兩端結(jié)扎線即可見兩結(jié)扎線間動(dòng)脈形成一段梭形凸起，動(dòng)脈壁膨不規(guī)則的，搏動(dòng)明顯，血管壁呈暗紅色（圖1d）。

2.1 正常頸總動(dòng)脈及生理鹽水對(duì)照組解剖和病理學(xué)結(jié)果 正常對(duì)照組頸總動(dòng)脈冠狀切片HE染色內(nèi)膜、中膜、外膜分層清楚，彈性纖維染色見彈性層豐富，以內(nèi)彈力層最厚（圖3a）。0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組術(shù)后7d、14d大體解剖顯示右側(cè)頸總動(dòng)脈與周圍組織無(wú)粘連，搏動(dòng)正常，HE染色和彈性纖維染色顯示血管結(jié)構(gòu)正常（圖 3d）。d、e、f彈力纖維染色。 3d（×40）顯示生理鹽水對(duì)照組頸總動(dòng)脈彈力層完整；3e（×40）顯示7d梭形動(dòng)脈瘤模型彈力層變化明顯；3d（×200）顯示14d從交界處始彈力層逐漸變薄的過(guò)程。

圖3 a、b、c HE染色（×40）。3a顯示正常頸總動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜、外膜結(jié)構(gòu)完整；3b顯示7天梭形動(dòng)脈瘤模型交界處外膜逐漸減少，動(dòng)脈管腔膨脹；3c顯示14天梭形動(dòng)脈瘤模型瘤腔處膜減少，內(nèi)膜逐漸增生

2.2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組影像學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠在豬胰彈性蛋白酶消化前血管直徑無(wú)明顯區(qū)別。生理鹽水對(duì)照組在消化25min后血管直徑增大不明顯，正常對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組分別于7d、14d動(dòng)脈造影，其中正常對(duì)照組平均值為（0.68±0.04）mm，生理鹽水對(duì)照組直徑平均值為（0.69±0.03）mm。實(shí)驗(yàn)組在消化 25min后及 7d、14d比對(duì)照組的血管直徑明顯增大，7d造影檢查測(cè)量動(dòng)脈瘤寬徑平均值為（1.37±0.02）mm。14d造影檢查測(cè)量動(dòng)脈瘤寬徑平均值為（1.39±0.03）mm。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7d、14d造影的動(dòng)脈瘤寬徑與正常對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組的比較運(yùn)用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7d、14d造影的動(dòng)脈瘤寬徑的比較運(yùn)用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7d、14d解剖和病理學(xué)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7d、14d大體解剖顯示右側(cè)頸總動(dòng)脈與周圍組織輕度粘連，頸總動(dòng)脈局部形成梭形凸起，搏動(dòng)明顯。HE染色顯示動(dòng)脈瘤外膜破壞，動(dòng)脈管腔明顯膨脹（圖3 b、c）。彈性纖維染色顯示載瘤動(dòng)脈的彈力層在動(dòng)脈瘤頸處逐漸減少變薄，動(dòng)脈瘤內(nèi)膜逐漸增生，但仍缺乏彈力層，膠原纖維增生明顯（圖 3e、f）。

3 討論

近年來(lái)國(guó)外學(xué)者開始嘗試?yán)脧椥缘鞍酌附Y(jié)合一定外科操作來(lái)制作實(shí)驗(yàn)鼠動(dòng)脈瘤模型[5]。也有學(xué)者應(yīng)用外科手法和彈性蛋白酶在家兔體內(nèi)制造出具有挑戰(zhàn)性的梭狀動(dòng)脈瘤[6]。Hosaka[7]將注入大鼠的基底池制作出顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂模型，評(píng)估彈力層破壞、炎癥細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞缺失和動(dòng)脈瘤壁平滑肌層增厚，可用于研究腦動(dòng)脈瘤的形成、破裂和治療國(guó)內(nèi)也有學(xué)者使用豬胰彈力蛋白酶消化兔頸總動(dòng)脈外膜使頸總動(dòng)脈呈梭形擴(kuò)張，并造成頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷有效地制作出梭形動(dòng)脈瘤模型[8]。Reinald等[9]利用彈力酶消化兔的頸總動(dòng)脈，成功地誘導(dǎo)出了梭形動(dòng)脈瘤，并指出彈力酶的濃度對(duì)血管壁的影響。

在對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈動(dòng)脈瘤模型的形態(tài)和病理學(xué)觀察時(shí)間的選擇上，我們參考了Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)彈力酶誘導(dǎo)鼠動(dòng)脈瘤模型2-3周組織的病理學(xué)即發(fā)生改變。而大鼠的血管造影只能選擇腹主動(dòng)脈穿刺，且造影后無(wú)法繼續(xù)存活，故對(duì)該梭形動(dòng)脈瘤模型的形態(tài)變化在多時(shí)間點(diǎn)的跟蹤測(cè)量上存在較大困難。綜上，我們選擇分別在1周和2周對(duì)大鼠進(jìn)行動(dòng)脈血管造影和灌注取材。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)1周和2周的血流沖擊，大鼠的頸總動(dòng)脈梭形動(dòng)脈瘤在形態(tài)學(xué)上趨于穩(wěn)定，但組織學(xué)上卻存在很大差異，7d時(shí)彈力纖維染色可見彈力層從交界處始變薄，14d時(shí)彈性纖維染色可見動(dòng)脈瘤壁表面由少細(xì)胞膠原成分覆蓋，結(jié)構(gòu)也較7d時(shí)更為完整。

雖然在造模時(shí)我們也限定了該梭形動(dòng)脈瘤模型的長(zhǎng)度，但實(shí)驗(yàn)組A和B在各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的動(dòng)脈血管造影顯示梭形動(dòng)脈瘤模型的長(zhǎng)徑存在差異較大，考慮造模過(guò)程中不能排除一定的豬胰彈性蛋白酶外溢可能，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)該梭形動(dòng)脈瘤模型的長(zhǎng)徑不做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的梭形動(dòng)脈瘤模型的寬徑較對(duì)照組發(fā)生顯著變化，說(shuō)明在血管外膜以及彈力層損傷的情況下，隨著血流動(dòng)力學(xué)的作用，動(dòng)脈瘤寬徑明顯增大，能夠形成較為穩(wěn)定的梭形動(dòng)脈瘤。而兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的梭形動(dòng)脈瘤寬徑比較則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可能與動(dòng)脈損傷后的自我修復(fù)以及實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的跨度選擇等相關(guān)，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究分析。該動(dòng)脈瘤模型在1周和2周的觀察過(guò)程中有類似于人類顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的自發(fā)性生長(zhǎng)過(guò)程,在血管腔內(nèi)持續(xù)的高應(yīng)力作用下，膨脹性生長(zhǎng)是否具有破裂可能，以及長(zhǎng)期開放的病理生理和影像學(xué)改變都有待更長(zhǎng)期隨訪研究,但該造模方法易于操作，實(shí)驗(yàn)成功率也較高，同時(shí)實(shí)驗(yàn)費(fèi)用也較低，梭形動(dòng)脈瘤模型經(jīng)過(guò)7d和14d的動(dòng)脈血管造影觀察發(fā)現(xiàn)形態(tài)較穩(wěn)定，能夠形成較成功的梭形動(dòng)脈瘤。病理學(xué)觀察該梭形動(dòng)脈瘤模型在結(jié)構(gòu)上類似于人類的顱內(nèi)梭形動(dòng)脈瘤,適用于梭形動(dòng)脈瘤的形成機(jī)制和病理學(xué)研究。