朱元，艾丹，鐘麗珍，王長(zhǎng)華

（江西省婦幼保健院生殖健康科，南昌 330006）

卵子冷凍技術(shù)一方面是腫瘤患者保存生育力的方式之一，另一方面也使得捐卵供卵成為可能[1]。相較于卵子冷凍，胚胎的冷凍往往會(huì)導(dǎo)致更多的倫理爭(zhēng)議和法律糾紛，因而受到了生殖領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[2]。然而由于卵母細(xì)胞的特殊性（體積大，紡錘體不耐受凍融等），卵母細(xì)胞的凍融復(fù)蘇率一直差強(qiáng)人意，遠(yuǎn)不如胚胎凍融的復(fù)蘇率高[3]。研究顯示，程序化冷凍法冷凍卵子后，會(huì)導(dǎo)致卵子一些重要基因表達(dá)下調(diào)[4,5]，而快速冷凍法也就是玻璃化冷凍技術(shù)則極小的影響了細(xì)胞內(nèi)的水分[6]，并且能很好的阻止在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶[7,8,9]，極大的提高了卵子的復(fù)蘇率，已成為目前卵子冷凍的主流方法。但是在玻璃化冷凍卵子的過(guò)程中，無(wú)論是暴露在冷凍保護(hù)劑中的時(shí)間，還是溫度都可能會(huì)損傷卵子進(jìn)而影響隨后的胚胎發(fā)育，因而我們需要不斷的摸索更優(yōu)良的冷凍技術(shù)。為提高凍融卵子技術(shù)，本研究應(yīng)用改良玻璃化冷凍法對(duì)小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，通過(guò)比較傳統(tǒng)玻璃化冷凍法和改良玻璃化冷凍法的復(fù)蘇率、受精率、優(yōu)胚率等，分析其凍融效果，為改良玻璃化冷凍在人類(lèi)卵母細(xì)胞上的應(yīng)用積累經(jīng)驗(yàn)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小白鼠：健康普通級(jí)6-8周齡昆明小白鼠，體重25-30g，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 卵母細(xì)胞的獲取 將8-10周齡雌性昆明小白鼠，腹腔注射10 IU／只HMG(寧波人健藥業(yè)有限公司)，48-50 h 后，注射 100 IU/只 HCG(寧波人健藥業(yè)有限公司)，于注射HCG后的18-20 h頸椎脫臼處死，取出輸卵管，置于培養(yǎng)液 （批號(hào)：505319，Vitrolife）中，解剖顯微鏡下，用注射器針頭劃開(kāi)輸卵管膨大部位，可見(jiàn)卵冠丘復(fù)合物，移入含80 IU／ml的透明質(zhì)酸酶溶液 (美國(guó)Sigma公司)中進(jìn)行消化，反復(fù)吹吸，脫顆粒，收集形態(tài)正常、第一極體是一級(jí)的卵母細(xì)胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h備用。

1.3 卵母細(xì)胞的玻璃化凍融方法 采用玻璃化冷凍試劑盒（批號(hào)：Y0847，Kitazato），其冷凍液包括平衡液（ES）和玻璃化冷凍液（VS），均于 4℃冰箱保存，使用前取出，置于室溫下平衡處理20-30min。⑴傳統(tǒng)玻璃化冷凍：采用吸卵管將卵子從培養(yǎng)液中吸出，置于ES表面，卵子自然下沉，于顯微鏡下觀察卵子形狀，卵子出現(xiàn)皺縮再恢復(fù)原形狀（整個(gè)過(guò)程為5-10 min）時(shí)，將卵子放入VS中，反復(fù)吹吸約30 s后，再將卵子裝載于全封閉載桿（CryoBioSystem）上，將載桿立即浸入液氮中使之迅速降溫，并置于液氮罐中保存。⑵改良玻璃化冷凍：用培養(yǎng)液做一個(gè)液滴，用ES做3個(gè)液滴，用VS做4個(gè)液滴，把卵子放在培養(yǎng)液中1min，然后從第一個(gè)ES液滴劃一個(gè)ES橋到培養(yǎng)液，1min后，再?gòu)牡诙€(gè)ES液滴劃一個(gè)橋到前面的ES橋，1min后，把卵子從培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入第3個(gè)ES,放置6min，然后將卵子放入VS中，在4個(gè)VS液滴中反復(fù)吹吸，約30 s后，再將卵子裝載于全封閉載桿（CryoBioSystem）上，將載桿立即浸入液氮中使之迅速降溫，并置于液氮罐中保存。⑶復(fù)蘇程序：采用玻璃化解凍試劑盒（批號(hào)：Z0872，Kitazat），其解凍液包括孵育液、稀釋液及洗脫液-1、-2，均于2-8℃保存。使用前，將孵育液于37℃條件下平衡20-30 min，稀釋液及洗脫液-1、-2，均于室溫下 （23℃）平衡20-30 min。將裝載冷凍卵子的全封閉載桿從液氮罐中取出，迅速放入孵育液中1min，使卵子脫落于孵育液中，然后將卵子依次置于稀釋液、洗脫液-1和洗脫-2中各3min，待卵子形態(tài)完全恢復(fù)后，將其轉(zhuǎn)移至受精培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3h。

1.4 小鼠精子的收集 頸椎脫臼法處死小鼠，取出附睪尾部，在培養(yǎng)液中用眼科剪剪碎該組織，使精子游離，20 min后祛除碎組織，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中使精子獲能1-2 h。采用精子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)精子的密度。

1.5 卵母細(xì)胞的受精和胚胎培養(yǎng) 凍存小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇之后在倒置顯微鏡下觀察其復(fù)蘇情況，統(tǒng)計(jì)其復(fù)蘇率。挑出存活的卵母細(xì)胞入受精液中培養(yǎng)1h后，行單精子顯微注射，注射后8-10h觀察受精情況。隨后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于授精后的16-24h在倒置顯微鏡下(×200)觀察受精及胚胎的體外發(fā)育情況，計(jì)算受精率、卵裂率以及優(yōu)胚率。

1.6 復(fù)蘇率、受精率、卵裂率以及優(yōu)胚率的評(píng)判復(fù)蘇率=存活卵母細(xì)胞存活數(shù)／解凍卵母細(xì)胞數(shù)x100%；受精率=受精卵子數(shù)／卵子總數(shù)×100%；卵裂率=卵裂數(shù)／受精總數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)／卵裂數(shù)×100%。小鼠胚胎的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照人類(lèi)胚胎的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]：一級(jí)胚胎為卵裂球均勻規(guī)則，折光度適中，透明帶完整，無(wú)碎片或碎片體積小于胚胎體積的10%；二級(jí)胚胎為卵裂球不均勻欠規(guī)則，折光度稍差，碎片體積小于胚胎體積的10%；三級(jí)胚胎為碎片體積小于胚胎體積的50%，剩余卵裂球形態(tài)和折光度與二級(jí)胚胎相當(dāng)，透明帶完整；四級(jí)胚胎為碎片體積大于胚胎體積的50%，剩余卵裂球外形清晰，但折光度變化較大；五級(jí)胚胎為d2為雙原核的延遲受精胚 胎；六級(jí)胚胎為卵裂球外觀不清、溶解、固縮、變黑的胚胎。本研究將一、二、三級(jí)胚胎定為可移植的優(yōu)質(zhì)胚胎；四、五、六級(jí)胚胎為劣質(zhì)胚胎。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

改良玻璃化冷凍組的復(fù)蘇率、卵裂率及優(yōu)胚率均高于傳統(tǒng)玻璃化冷凍組(P<0.05),兩組的受精率無(wú)顯著性差異（P>0.05）(見(jiàn)表 1)。

表1 不同冷凍方法對(duì)卵子的影響

3 討論

從1986年Chen第一例成功凍存人卵并妊娠到現(xiàn)在已經(jīng)有30余年，這期間人們一直在探索更高效、方便、經(jīng)濟(jì)的卵子凍存方法，但是一直進(jìn)展緩慢。慢速冷凍法由于細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，卵母細(xì)胞容易死亡，玻璃化冷凍法成功避免了冰晶的形成，但是由于增加了高濃度的冷凍保護(hù)劑，對(duì)細(xì)胞的毒性增加。此外，玻璃化冷凍還有經(jīng)濟(jì)（不需要昂貴的程序冷凍儀器）、方便及快捷的優(yōu)點(diǎn)，因而現(xiàn)在已成為卵子冷凍以及胚胎冷凍的主流方法[11,12]，目前國(guó)內(nèi)主要應(yīng)用于IVF-ET治療中取卵日男方取精困難或特殊原因無(wú)法取精，補(bǔ)救性的冷凍卵子[11]，改日解凍卵子后形成胚胎再移植，目前已有成功妊娠報(bào)道[13]。但是無(wú)論是慢速冷凍和玻璃化冷凍隨后的妊娠率都低于新鮮卵子的妊娠率[14]。Chen[15]的研究顯示，由于卵母細(xì)胞中的紡錘體對(duì)凍融過(guò)程中的滲透壓及冷凍保護(hù)劑等都十分敏感，容易受損，所以雖然復(fù)蘇率高，但是隨后的胚胎非整倍體高，容易發(fā)育停滯。對(duì)卵母細(xì)胞造成的損傷主要來(lái)源于冷凍保護(hù)劑的滲透損傷以及冷凍過(guò)程中冰晶形成的機(jī)械性的損傷[16]。這些因素可能會(huì)影響紡錘體、卵母細(xì)胞的細(xì)胞骨架以及染色體等，進(jìn)而影響隨后卵母細(xì)胞的受精、卵裂以及妊娠。為減少冷凍損傷的影響，產(chǎn)生了多項(xiàng)改進(jìn)的辦法，比如使用不同的冷凍載體、采用單精子顯微注射避免透明帶硬化的弊端以及聯(lián)合多種冷凍保護(hù)劑來(lái)盡可能減少滲透損傷和毒性[16,17]。

為減少滲透壓急劇變化對(duì)卵子的負(fù)面影響，我們創(chuàng)造了這種改良的玻璃化冷凍方法，將卵子在培養(yǎng)液中放置1min后，從第一個(gè)ES液滴劃一個(gè)ES橋連接到培養(yǎng)液，1min后，再?gòu)牡诙€(gè)ES液滴劃一個(gè)橋連接到前面的ES橋，1分鐘后，把卵子從培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入第3個(gè)ES液滴，這么做的目的就是為了讓滲透壓逐步升高，減少滲透壓急劇變化對(duì)卵子的負(fù)面影響。而我們的研究結(jié)果也證明，這種改良的玻璃化冷凍方法確實(shí)在隨后卵子的復(fù)蘇率、卵裂率以及優(yōu)胚率上都優(yōu)于傳統(tǒng)的玻璃化冷凍方法。受精率兩組區(qū)別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)槲覀儾捎昧薎CSI受精的方式保證了受精?？傊?，改良玻璃化冷凍法比傳統(tǒng)玻璃化冷凍法更有優(yōu)勢(shì)，具有首創(chuàng)性，值得推廣。