李 瑩，曹 森，劉志剛，趙治兵，田 馳，王 瑞*

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005； 2.貴陽市花溪區(qū)市場監(jiān)督管理局，貴州 貴陽 550025）

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖，又名赤箭、獨搖芝、離母，主產(chǎn)于貴州、云南、四川、陜西等地，是我國名貴中藥材之一，其味甘、性平，具有息風(fēng)止痙、鎮(zhèn)靜安眠、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，用于治療小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、頭痛眩暈等病癥［1-2］，同時有著神經(jīng)保護功能，在增強智力、防治老年癡呆等方面有一定效果［3-5］。它主要含天麻苷類及其酚類、有機酸類、甾醇類、多糖類化合物，其中天麻素（天麻苷）、對羥基苯甲醇（天麻苷元）、對羥基苯甲醛等酚類成分是其主要活性物質(zhì)，另外現(xiàn)有研究表明，腺苷、天麻素藥效作用相似，也可將兩者視為該類成分［6-7］。天麻干品質(zhì)地硬，藥用和食用相對困難，而且與鮮品相比既降低了營養(yǎng)成分，又改變了氣味及口感［8］，近年來以鮮品為原料生產(chǎn)加工的保健品和藥膳逐漸受到關(guān)注，但目前相關(guān)活性成分的研究主要是針對經(jīng)過炮制處理后的干天麻，鮮有涉及鮮天麻［9］。因此，本實驗采用HPLC 法同時測定鮮天麻中腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛的含有量，以期為客觀全面評價其質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

LC-15C 型高效液相色譜儀、AUW120D 型電子分析天平（日本島津公司）；KQ-5200DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。腺苷（批號20160523）、天麻素（批號20161217）、對羥基苯甲醇（批號20160317）、對羥基苯甲醛（批號20160415）對照品均購于上海金穗生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98.0%。天麻采自貴州省大方縣烏蒙騰菌業(yè)有限公司實驗基地，品種為烏天麻，經(jīng)貴陽學(xué)院武孔云教授鑒定為蘭科天麻屬植物天麻Gastrodia elataBl.的新鮮塊莖。乙腈、甲醇為色譜純（美國Tedia 公司）；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含水量測定 鮮品清洗干凈后切薄片（1～2 mm），平行3 份，烘干法［1］測得其平均含水量為82.09%，RSD為1.1%。

2.2 色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0～30 min，3%～5% A；30～35 min，5%～20% A；35～45 min，20%～50% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長270 nm；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，10%甲醇制成每1 mL 分別含腺苷0.02 mg、天麻素0.2 mg、對羥基苯甲醇0.15 mg、對羥基苯甲醛0.02 mg 的溶液，即得。

2.4 供試品溶液制備 精密稱取0.5 g 鮮品粉碎，加入一定量80%甲醇，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，再加入80%甲醇至20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（200 W、40 kHz）45 min 后放冷至室溫，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量。精密量取5 mL 上清液于具塞試管中，加入10 mL 甲醇并振搖5 min，白色絮狀沉淀產(chǎn)生完全后離心10 min（4 000 r／min），濃縮上清液，殘渣用80%甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，定容后搖勻，0.45 μm 微孔濾膜進行濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 將對照品溶液梯度稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y）對溶液質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定6 次，測得腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛峰面積RSD 分別為0.6%、0.1%、1.1%、0.1%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取適量鮮品，按“2.4”項下方法制備供試品溶 液，室 溫下于0、3、5、6、8、12、24 h 在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛峰面積RSD 分別為1.4%、1.7%、0.2%、2.1%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批鮮品，按“2.4”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛含有量RSD 分別為0.4%、1.0%、0.4%、2.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取含有量已知的鮮品9 份，每3份為1 組，加入適量對照品溶液，按“2.4”項下方法制成高、中、低3 個質(zhì)量濃度的供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表2。

2.6 樣品含有量測定 按“2.4”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，外標(biāo)法計算含有量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實驗比較了甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸、甲醇-0.1% 甲酸、甲醇-0.05% 磷酸、乙腈-0.05% 磷酸等，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.05%磷酸為流動相梯度洗脫時，出峰時間合適，色譜峰分離度好，理論塔板數(shù)以天麻素、對羥基苯甲醇計大于10 000，符合2015 版《中國藥典》規(guī)定的大于5 000。然后，對腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛在200～400 nm 處進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)四者最大吸收波長分別為260、270、270、280 nm，故選擇270 nm 作為檢測波長，此時各成分響應(yīng)值較好。接著，考察了回流、超聲提取，發(fā)現(xiàn)后者重復(fù)性明顯更高，再比較超聲30、45、60 min，發(fā)現(xiàn)30 min 時各成分含有量較低，而45、60 min時含有量較高且結(jié)果相近，考慮到效率方面，故選擇45 min作為提取時間，同時超聲提取后加入甲醇并離心時，可去除多糖類成分對有含量測定的干擾。同時，對溫度也進行了考察，發(fā)現(xiàn)25 ℃時色譜峰分離度高于18 ℃，故選擇在25 ℃下測定。

3.2 含有量分析 表3 顯示，不同批次鮮天麻均含有腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛，以天麻素含有量最高，其次是對羥基苯甲醇、腺苷，對羥基苯甲醛最低，與干品一致［10-12］。由此可知，同一產(chǎn)地不同批次鮮天麻中相同成分含有量存在一定差異，故對其質(zhì)量控制進行深入研究、建立合理的含有量測定方法非常重要。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）

表3 各成分含有量測定結(jié)果（n＝3）

4 結(jié)論

目前，關(guān)于天麻有效成分的研究主要集中于炮制品，但其炮制方法多樣，對主要成分含有量的影響也較大［13-14］，以潤制、蒸制為主［15］，其中硫磺熏蒸法由于操作簡單、成本低廉、成品外觀好而更為常用。但硫熏程度的差異會導(dǎo)致天麻質(zhì)量嚴(yán)重不一，而且硫磺含砷量較高，易在加工過程中引入雜質(zhì)，危害人類健康，故直接測定鮮天麻中有效成分含有量可避免炮制過程對其變化的影響，并能更客觀準(zhǔn)確地評價該藥材質(zhì)量。

2015 年版《中國藥典》以天麻素、對羥基苯甲醇含有量總和為質(zhì)量控制指標(biāo)［16］，但現(xiàn)代藥理研究表明，中藥藥效的發(fā)揮離不開多種活性成分的共同作用，故多種成分含有量同時測定才能滿足中藥質(zhì)量評價的需求。本實驗建立HPLC 法同時測定鮮天麻中腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛的含有量，該方法靈敏度高，分離度好，可重復(fù)性強，可為全面客觀地評價該藥材質(zhì)量提供參考。