方馬一佳，萬海同，潘璐佳，鄭艷秋，何 昱

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

腦缺血在臨床腦血管疾病中最為常見，約占80%，它具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點，嚴(yán)重影響人類的健康，但目前仍缺乏有效的治療藥物［1］。

腦缺血是一個復(fù)雜的病理過程，中醫(yī)學(xué)上歸屬于“中風(fēng)”的范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，血瘀是缺血性中風(fēng)的病理核心，而氣虛為根源，因此治療方法常以益氣活血法為主［2-3］。

從現(xiàn)代藥理學(xué)角度出發(fā)，黃芪、紅花中的許多組分均對腦缺血損傷有較好的治療作用，如黃芪甲苷能通過降低缺血腦組織的自由基水平、提高超氧化物歧化酶等達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用［8-9］；紅花中的主要成分羥基紅花黃色素A可以通過保護(hù)腦組織、抗血小板聚集等發(fā)揮抗腦缺血的作用［10］。

基于中藥多成分多靶點的特點，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從整體上對藥物以及疾病的靶點進(jìn)行預(yù)測，更直觀地理解藥物與機(jī)體的相互作用關(guān)系［11］，從而在分子層面闡明成分靶點和疾病靶點之間的潛在關(guān)系。因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，為進(jìn)一步揭示黃芪-紅花治療腦缺血的作用機(jī)制，探討其配伍關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要活性成分及成分靶點的收集 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：／／lsp.nwsuaf.edu.cn）是一個非常全面的中藥成分系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫，主要用于化學(xué)成分的查找［12］。在該數(shù)據(jù)庫中分別以“紅花”“黃芪”為關(guān)鍵詞搜索化學(xué)成分，檢索到紅花中化合物共189 個，黃芪中化合物89 個。然后根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫的建議及參考其他文獻(xiàn)［13］，以口服利用度（OB）≥30% 和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，最后篩選得紅花成分22 個，黃芪成分20 個。雖然篩選過程中紅花中的羥基紅花黃色素A、紅花黃色素因OB＜30%不符合篩選條件，但經(jīng)文獻(xiàn)查找，該成分對治療腦缺血確有作用，如羥基紅花黃色素A 預(yù)防及治療給藥均可以減少SD 大鼠腦缺血半暗帶區(qū)HSP70 蛋白的表達(dá)［14］，紅花黃色素對控制性低血壓誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可降低死亡率［15］，因此也將其計入。此外，為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用目前全球最大的中醫(yī)藥小分子數(shù)據(jù)庫之一，即TCM 數(shù)據(jù)庫（http：／／tcm.cmu.edu.tw／）［16］，同樣以“紅花”“黃芪”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索。將2 個數(shù)據(jù)庫中的化學(xué)成分去除重復(fù)項后整理于Excel 表格上。

通過STITCH 數(shù)據(jù)庫［17］，將Organism 設(shè)定為Homo sapiens，對成分靶點進(jìn)行收集。

1.2 疾病靶點的收集 OMIM 數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man；http：／／www.omim.org）為用于描述人類遺傳病以及基因研究的知識庫［18］，TTD 數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database；https：／／db.idrblab.org／ttd／）是可以提供已知的包括未知的正在探索的治療蛋白以及核酸目標(biāo)信息的數(shù)據(jù) 庫［16］，DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：／／www.drugbank.ca／）則包含有藥物、藥物靶點、分子信息的生物信息學(xué)和化學(xué)信息［19］。分別在這3 個數(shù)據(jù)庫內(nèi)以“cerebral ischemic stroke”“cerebral infarction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集與腦缺血相關(guān)的靶點，去除重復(fù)項后整理于Excel 上。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)參考文獻(xiàn)中所述方法［20］，利用Cytoscape 3.6.1 軟件分別構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡(luò)、成分靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)、疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)、成分靶點與疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)。在構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡(luò)時，將整理所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件即可；在構(gòu)建成分靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)時，選擇Bisogenet 插件，將方法設(shè)置為“Input nodes and its neighbors”，參數(shù)為1，輸出方式為基因；在構(gòu)建成分靶點與疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)時，將方法改為“Input nodes only”，其余不變。最后利用其中的Merge 功能，將相互作用網(wǎng)絡(luò)合并，取交集部分，最終獲得黃芪-紅花中治療腦缺血的候選靶點。

1.4 通路整合與分析 將獲得的候選靶點導(dǎo)入MAS 3.0（http：／／bioinfo.capitalbio.com）在線分析工具［21］，進(jìn)行基因本體生物學(xué)過程GO（gene ontology biology process）富集分析以及基因組百科全書KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注釋分析［22］，繪制條形圖。

賽珍珠女士(Pearl S.Buck)將中國名著《水滸傳》的書名譯為《All Men Are Brothers》，單從字面看覺得該翻譯沒有表達(dá)出原著的意圖，但是譯者考慮到無法用“water”直譯“水”，“滸”指“水邊，離水稍遠(yuǎn)的岸上陸地”(waterside)，“傳”可譯為“novel”，如果只是將中文對應(yīng)的英文串聯(lián)起來則毫無意義。因此，譯者有意識地誤譯讓外國讀者從書名也可以猜測出該著作有關(guān)俠義之事。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)成分、疾病靶點的收集 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中黃芪20 個，紅花22 個；TCM 數(shù)據(jù)庫中黃芪22 個，紅花22 個。利用STITCH 數(shù)據(jù)庫對這些化合物以及文獻(xiàn)查找所得的化合物（羥基紅花黃色素A、紅花黃色素）進(jìn)行成分靶點收集，其中共計有靶點的化合物為36 個，對應(yīng)的成分靶點共176 個。見表1。

以cerebral ischemic stroke、cerebral infarction 為關(guān)鍵詞在OMIM、TTD、DrugBank 這3 個數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲得相關(guān)疾病的靶點共164 個。

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.2.1 成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 將整理于Excel 上的成分以及成分靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件，共得到節(jié)點203 個，邊255條，見圖1。并將成分及成分靶點進(jìn)行度值（Degree）評價，選擇了排名靠前的10 條，其中2 者的共同成分kaempferol（山柰酚）、quercetin（槲皮素）、γ-sitosterol（γ-谷甾醇）度值較高，靶點中CASP3 度值最高，見表2。

表1 成分及對應(yīng)的靶點數(shù)目

圖1 黃芪-紅花藥對的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 成分及成分靶點度值

2.2.2 成分靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 在成分靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點（即相互作用蛋白）5 586 個，邊（即相互作用關(guān)系）139 089 條。見圖2。

圖2 黃芪-紅花藥對成分靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2.3 疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 在疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點（即相互作用蛋白）5 506 個，邊（即相互作用關(guān)系）119 789 條。見圖3。

圖3 腦缺血相關(guān)靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2.4 成分靶點與疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 在該網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點（即相互作用蛋白）328 個，邊（即相互作用關(guān)系）815 條。見圖4。

圖4 黃芪-紅花藥對成分靶點和腦缺血相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2.5 網(wǎng)絡(luò)合并 對3 個相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)合并，共獲得節(jié)點172 個，即黃芪-紅花藥對治療腦缺血的候選蛋白共172 個，見圖5。對候選靶點進(jìn)行度值（Degree）評價，選出靠前的10 條，見表3。

圖5 黃芪-紅花藥對治療腦缺血的候選靶點

表3 部分候選靶點的度值

2.3 通路整合分析 GO 富集分析包括3 個分支，分子功能、生物過程、細(xì)胞組成［23］。GO 分析結(jié)果顯示，在分子功能方面，黃芪-紅花藥對主要通過蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、核苷酸結(jié)合等對腦缺血產(chǎn)生影響；在生物過程方面，主要是抗凋亡、蛋白氨基酸、磷酸化等。其中P值越小，該基因在GO 中富集越多。見圖6。

圖6 黃芪-紅花藥對候選靶點的部分GO 富集分析

為了進(jìn)一步闡明候選靶點與哪些通路有關(guān)，還進(jìn)行了KEGG 通路分析。在靠前的20 條中，包括11 條疾病通路及8 條信號通路（MAPK、ErbB、Toll 樣受體、脂肪細(xì)胞因子、GnRH、T 細(xì)胞受體、Fc epsilonRI、p53 信號通路）。見圖7。

圖7 黃芪-紅花藥對候選靶點的部分KEGG 通路分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)這兩個角度來闡明疾病的發(fā)生發(fā)展的一種研究方法，通過對中藥成分及作用靶點的收集，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步考察中藥對不同信號的調(diào)節(jié)作用，從而揭示中藥作用的機(jī)制［24-25］。本研究探討黃芪-紅花藥對治療腦缺血的機(jī)制，也是在它們的多成分與機(jī)體疾病的多靶點的非線性的相互作用關(guān)系的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。

本次研究，從黃芪-紅花中共收集到36 個化合物，176個成分靶點，從圖1 和表1 中可以看出kaempferol（山柰酚）、quercetin（槲皮素）、γ-sitosterol（γ-谷甾醇）作為2者的共同成分，不僅所對應(yīng)的成分靶點相對較多，而且度值也相對較高，這表明它們可能是該藥對在抗腦缺血方面發(fā)揮作用的重要成分。此外，CASP3 作為黃芪-紅花中的一個共同靶點，它的度值最高，為10，有研究表明caspase-3作為caspase 家族中熱點研究的蛋白，在腦缺血再灌注損傷中的作用也備受關(guān)注，是啟動缺血腦區(qū)受損神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［26］。

在對篩選得到的172 個候選靶點進(jìn)行GO 分析和KEGG分析時，從GO 分析的結(jié)果來看（圖6），在分子功能方面蛋白結(jié)合P值最小，與腦缺血關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)存在于正常大鼠的腦組織內(nèi)的血紅素結(jié)合蛋白（HPX）可以清除有害的游離血紅素，當(dāng)發(fā)生腦缺血后，HPX 的表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮腦保護(hù)的作用［27］。又如當(dāng)纖維蛋白原等凝血因素明顯升高時，會使人體內(nèi)的凝血及纖溶機(jī)制發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致腦血栓的形成，加重腦缺血［28］。

除此之外，細(xì)胞凋亡這一生物過程也對腦缺血有一定的影響。有研究表明，在腦中風(fēng)早期，神經(jīng)細(xì)胞以壞死為主，其后以凋亡為主，并且在大鼠局灶性腦缺血的模型中都發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［29］。而從黃芪-紅花藥對中篩 選出來的172 個候選靶點中，NOS［30］、COX［31］、CASP［26］等均與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

在進(jìn)行KEGG 通路注釋分析時（圖7），MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、ErbB 信號通路這幾條通路P 值較小，被顯著富集。其中MAPK 信號通路被認(rèn)為是最主要的信號通路。MAPK 級聯(lián)反應(yīng)在缺血、缺氧等病理條件的刺激下可被激活，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對腦缺血后有神經(jīng)保護(hù)作用［32］，侯昆［33］通過實驗說明P38 MAPK 被抑制后，小鼠的神經(jīng)功能得到修復(fù)，對腦缺血具有保護(hù)作用。

Toll 樣受體信號通路中的TLR4 有介導(dǎo)腦缺血損傷作用，當(dāng)TLR4 被阻斷后能抑制TNFα、IL-1β、iNOS 等炎性因子的表達(dá)，因此，阻斷TLR4 抗體可對腦缺血起到神經(jīng)保護(hù)功能［34］。

雖然在預(yù)測到的通路中，ErbB 信號通路，在劉楠等［20］對補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行腦缺血作用機(jī)制的研究中也有報道，但主要通路與補(bǔ)陽還五湯中所報道的PI3K／Akt 通路不同。雖同為治療腦缺血，但在補(bǔ)陽還五湯中除了黃芪紅花外，還有當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍、赤芍相配伍，其中的當(dāng)歸可以通過激活PI3K／Akt 通路調(diào)節(jié)人內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，在動脈粥樣硬化及相關(guān)心腦血管疾病的治療中具有重大價值［35］，川芎中的主要成分川芎嗪則可以通過該通路對心肌缺血性損傷起到保護(hù)作用［36］。而在本次研究中，只有紅花黃芪相配伍，紅花中的主要成分羥基紅花黃色素A 能通過MAPK 通路改善大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能損傷，從而起到腦缺血的治療作用［37］，黃芪中的黃芪多糖也能通過MAPK 通路減少人微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注中NF-kB 的表達(dá)，進(jìn)而抑制再灌注損傷中部分黏附因子的表達(dá)［38］。故而可以推測黃芪-紅花治療腦缺血，MAPK 通路是其關(guān)鍵機(jī)制之一。

除上述3 條通路外，還有脂肪細(xì)胞因子、GnRH、T 細(xì)胞受體、Fc epsilonRI 和p53 信號通路，其中p53 信號通路與腦缺血的關(guān)系報道較多，有研究表明在多種腦缺血動物模型中p53 表達(dá)上調(diào)，并作為一種促凋亡因子發(fā)揮作用，此外，p53 表達(dá)下調(diào)后能有效減少梗死面積［39］。其他通路現(xiàn)有的文獻(xiàn)研究報道較少，可以在后續(xù)的實驗中進(jìn)行探討。

此外，黃芪、紅花在抗腦缺血靶點上有著較大的重復(fù)性，如CASP3、TLR4、APOB、AKT1 等均為共同靶點，在這其中CASP3 的度值最高為10，說明了CASP3 可能是黃芪-紅花藥對中相對重要的靶點。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測出了黃芪-紅花治療腦缺血的主要機(jī)制，但由于數(shù)據(jù)庫的信息尚不夠完全，該研究還有一些局限性，需要在今后的研究中進(jìn)一步闡明黃芪-紅花中活性成分的作用靶點，使機(jī)制的探討更為全面。