劉思妍，王 芯，潘奕璇，李艷玲，張 梅*，謝學(xué)軍

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075）

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病微血管病變中最主要的并發(fā)癥之一，也是成年人視力損害的主要原因之一［1］。補(bǔ)腎活血方（地黃、丹參、人參、葛根配伍組成）由本課題組成員研制并獲得發(fā)明專利［2］，前期臨床和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)［3-6］均表明補(bǔ)腎活血方防治DR 顯示良好的效果。研究認(rèn)為，影響DR 發(fā)生的重要因素是心脾虧虛、因虛致疲、目絡(luò)阻滯，因此，補(bǔ)益肝腎、益氣活血是治療DR 的主要用藥準(zhǔn)則。地黃性微溫，味甘，歸肝腎經(jīng)，有滋陰補(bǔ)腎、益精明目之功，能補(bǔ)虛治本，是補(bǔ)腎之要藥，也是補(bǔ)腎活血方的君藥。因此，本研究以地黃為研究對象，通過譜效關(guān)系研究地黃防治DR 的可能藥效物質(zhì)，為最終闡明補(bǔ)腎活血方防治DR 藥效物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia.glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，具有清熱養(yǎng)血、養(yǎng)陰生津等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，地黃具有細(xì)胞毒活性、抗糖尿病及其并發(fā)癥、抗炎等藥理作用；化學(xué)成分研究表明，地黃中主要含有環(huán)烯醚萜類、紫羅蘭酮類、苯乙醇苷類、糖類等化合物［7］。建立在中藥指紋圖譜基礎(chǔ)上的譜效關(guān)系研究可在一定程度上揭示中藥藥效物質(zhì)，該研究在中藥領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［8］，然而，采用譜效關(guān)系研究地黃防治DR 藥效物質(zhì)還未見報道。因此，本研究采用偏最小二乘法，首次獲得不同來源地黃指紋圖譜中特征峰峰面積與糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycationend products，AGEs）干預(yù)下視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)量之間的譜效關(guān)系，為地黃防治DR的可能藥效物質(zhì)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 10 批不同來源的地黃經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定，均為玄參科植物地黃的新鮮或的干燥塊根。具體見表1。

對照品：梓醇（成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷（成都普思生物科技股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）。乙腈（美國Fisher 公司，色譜純）。HIF-1α 檢測試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）。大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞完全培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，CM-R117）；胰酶（hyclone）、二甲基亞砜（biosharp）、糖基化終末產(chǎn)物（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號AF10187656）。

表1 樣品來源

1.2 儀器 Agilent 1200 系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；DZQ-6050真空干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；BP121S 分析天平（德國Sartorius 公司）；超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；5% CO2恒溫培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)國際貿(mào)易有限公司）；倒置生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；臺式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.3 細(xì)胞 大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，CP-R117）。

2 方法與結(jié)果

2.1 10 批地黃HPLC 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 Inertsil OSD-SP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，0；12～15 min，0～3% A；15～20 min，3%～6%A；20～25 min，6%～8%A；25～30 min，8%～12%A；30～35 min，12%～16% A；35～45 min，16%～20% A；45～55 min，20%～25%A；55～60 min，25%A～0）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長203 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取梓醇、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷對照品適量，加超純水溶解后合并至同一量瓶中，超純水定容，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取地黃粗粉約2.0 g，精密稱定，精密加入100.0 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，棄去初濾液，精密量取25.0 mL 續(xù)濾液置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，供藥效實(shí)驗(yàn)使用。另取25.0 mL 續(xù)濾液，揮干，殘渣以超純水溶解，定容至2 mL 量瓶，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察，結(jié)果顯示各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.1.5 HPLC 指紋圖譜峰的歸屬 分別吸取10 批不同來源地黃供試品、對照品溶液各20 μL，在“2.1.1”項色譜條件下分析，得到HPLC 指紋圖譜（圖1）。根據(jù)國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008 版）軟件，生成共有峰圖譜（圖2A），標(biāo)定17 個共有峰（表2），指認(rèn)出4、14、15 號峰分別為梓醇、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷（圖2B），其余色譜峰有待確定。將10 批不同來源地黃進(jìn)行相似度評價，結(jié)果顯示相似度均大于0.8，表明各批地黃化學(xué)成分組成上相似度較高，見表3。

圖1 10 批地黃HPLC 指紋圖譜

2.2 地黃對視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞HIF-1α 表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞，以4×104／mL 細(xì)胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)設(shè)置正常組、AGEs 組（質(zhì)量濃度為150 mg／L）和AGEs＋藥物組（10批不同來源地黃，質(zhì)量濃度為200 μg／mL），每組6 個重復(fù)。給藥之后每孔補(bǔ)充培養(yǎng)基至200 μL，放入5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，48 h 后收集上清液，取50 μL，按照ELISA 檢測試劑盒操作，檢測HIF-1α 表達(dá)。

圖2 10 批地黃的特征共有峰、對照品色譜圖

表2 10 批地黃共有峰保留時間及峰面積

表3 10 批地黃指紋圖譜相似度

由表4 可見，與正常組比較，AGEs 組視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞上清液中HIF-1α 表達(dá)升高（P＜0.01）；與AGEs 組比較，S2、S6 組細(xì)胞上清液中HIF-1α 表達(dá)降低（P＜0.05）。

將各樣品組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與AGEs 組進(jìn)行比較，得到各組的比較藥效值，計算公式為藥效值＝AGEs 組HIF-1α 值－樣品組HIF-1α 值，結(jié)果見表5。

2.3 譜效關(guān)系分析 以10 批不同來源地黃HPLC 指紋圖譜中各特征峰的峰面積為自變量（X），以HIF-1α 表達(dá)量的藥效值為因變量（Y），運(yùn)用Matlab R2017a 軟件，采用PLSR 對二者進(jìn)行譜效相關(guān)性分析，計算出各自變量關(guān)于因變量的回歸系數(shù)。運(yùn)用回歸系數(shù)建模，即得如下回歸方程：

表4 各組細(xì)胞中HIF-1α 水平（±s，n＝6）

表4 各組細(xì)胞中HIF-1α 水平（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與AGEs 組比較，*P＜0.05。

Y＝－0.054 8X1－0.202 3X2－0.059 7X3－0.193 6X4＋0.077 2X5－0.029 8X6－0.113 2X7－0.023 8X8－0.210 0X9－0.071 2X10－0.140 1X11－0.008 4X12＋0.153 0X13＋0.156 8X14＋0.029 1X15＋0.071 0X16＋0.024 2X17。從圖3 中可以看出，14、13、5、16、15、17 號色譜峰的回歸系數(shù)為正，表明其與降低HIF-1α 表達(dá)量呈正相關(guān)，而其余色譜峰呈負(fù)相關(guān)，其中4 號峰為梓醇。

綜上所述，初步確定肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷及4 個尚未確定結(jié)構(gòu)的成分（峰13、5、16、17）為地黃防治DR的可能藥效物質(zhì)。

3 討論

Müller 細(xì)胞分布于整個視網(wǎng)膜，是視網(wǎng)膜內(nèi)最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其在維持正常的視網(wǎng)膜谷氨酸代謝、營養(yǎng)支持神經(jīng)元及保持血-視網(wǎng)膜屏障完整性等方面發(fā)揮重要作用［9］。Müller 細(xì)胞病理改變及其損傷機(jī)制已成為DR 研究中一個值得關(guān)注的問題。高糖和缺氧是影響DR 發(fā)生發(fā)展的2 個最重要的因素。近年來，課題組前期研究和其它文獻(xiàn)資料［10-11］均顯示，高糖可以降低體外培養(yǎng)的Müller 細(xì)胞的生物學(xué)功能。同時，文獻(xiàn)報道［12］，隨著DR 病程的進(jìn)展，Müller 細(xì)胞的功能和活性發(fā)生改變。AGEs 是機(jī)體在長期慢性高血糖狀態(tài)下形成的一種不可逆的終末產(chǎn)物。AGEs可通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶通路活化HIF-1α，從而刺激血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的增加，促使DR 的發(fā)生和發(fā)展。HIF-1α 是調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子［13］，其能夠廣泛激活缺氧相關(guān)生理反應(yīng)的下游基因，促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄，如VEGF、NOS 和糖酵解酶等［14-15］，進(jìn)而增強(qiáng)組織細(xì)胞對缺氧環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力。同時，HIF-1α 是血管生長信號途徑的關(guān)鍵上游轉(zhuǎn)錄因子，與血管相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16-17］。因此，本研究通過考察不同來源地黃在AGEs 條件下對視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞中HIF-1α 表達(dá)的影響，評價其防治DR 的藥理作用。結(jié)果表明，不同來源的地黃均具有一定的防治DR作用。

表5 HIF-1α 表達(dá)的因變量Y 對應(yīng)的藥效值

圖3 PLSR 回歸系數(shù)柱狀圖

結(jié)合中藥指紋圖譜和其藥效指標(biāo)，通過分析二者的相關(guān)性研究（即譜效關(guān)系），闡釋圖譜特征與藥效之間的關(guān)系，能夠從中快速有效的選取成分復(fù)雜中藥的藥效物質(zhì)，也可追蹤分離藥理活性成分，進(jìn)而全面表征中藥內(nèi)在質(zhì)量。因此，本研究在獲得地黃指紋圖譜及藥效信息的基礎(chǔ)上，采用譜效關(guān)系，建立地黃防治DR 的譜效關(guān)系，以期闡明地黃防治DR 的藥效物質(zhì)。

本研究采用PLSR 分析了10 批不同來源的地黃中各共有峰峰面積與AGEs 干預(yù)下視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞中HIF-1α 的表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果表明肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷及4個尚未確定結(jié)構(gòu)的成分（峰13、5、16、17）為地黃防治DR 的可能藥效物質(zhì)。本研究亦對不同來源的地黃中肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷的含有量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明：不同來源的地黃中肉蓯蓉苷A 的含有量在0.007%～0.022% 之間；毛蕊花糖苷的含有量在0.021%～0.129% 之間。查閱文獻(xiàn)可知，陶玉菡等［18］發(fā)現(xiàn)在抑制AGEs 生成方面，地黃中毛蕊花糖苷作用較顯著。Yu 等［19］從對糖尿病并發(fā)癥有效的B.hancei的莖和葉中分離出毛蕊花糖苷，研究發(fā)現(xiàn)其對AGEs 的形成有明顯的抑制作用。Li 等［20］發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷有預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的作用。這與本研究發(fā)現(xiàn)地黃中的化合物毛蕊花糖苷與防治DR 藥效呈相關(guān)性的結(jié)果一致。后期將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證各成分藥效作用，并進(jìn)行未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，確定地黃防治DR 的藥效物質(zhì)，為最終闡明補(bǔ)腎活血方防治DR 藥效物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。