占心佾，甘海寧，李鈺婷，陳玉興，李茹月，黃丹娥

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095）

免疫是人體的一種生理功能，依靠該功能區(qū)分“自己”和“非己”成分，從而破壞和排斥進(jìn)入人體的抗原物質(zhì)或自身產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞等，以維持人體的健康。免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫活性物質(zhì)組成。當(dāng)免疫功能過(guò)低時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)免疫缺陷綜合征，產(chǎn)生各類疾病。目前臨床用于治療免疫低下導(dǎo)致相關(guān)疾病的藥物并不多，大都只能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞或體液免疫的某一靶點(diǎn)產(chǎn)生效應(yīng)，但機(jī)體免疫系統(tǒng)及其復(fù)雜，任何針對(duì)靶點(diǎn)的免疫增強(qiáng)藥物，臨床療效均不理想［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為免疫力相當(dāng)于人體正常功能的“正氣”，是針對(duì)導(dǎo)致疾病的病邪而言的［2］。為調(diào)節(jié)人體免疫機(jī)能，中醫(yī)學(xué)提出扶正與祛邪兩大治療法則，對(duì)于過(guò)亢的免疫反應(yīng)多采用以祛邪為主的治則，達(dá)到“邪去則正安”；對(duì)于免疫反應(yīng)低下者，多采用扶正治則為主，達(dá)到“扶正以祛邪”［3］。玉屏風(fēng)散是中醫(yī)扶正固本的經(jīng)典名方，由黃芪、白術(shù)和防風(fēng)三味藥組成，有扶正止汗、祛邪御風(fēng)等功效［4］。目前臨床廣泛用于免疫調(diào)節(jié)、哮喘、蕁麻疹等過(guò)敏反應(yīng)。本文以玉屏風(fēng)顆粒作為研究對(duì)象，探索其對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫缺陷大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)44007200053987。實(shí)驗(yàn)環(huán)境為廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)SYXK（粵）2015-0059。

1.2 試劑與藥物 玉屏風(fēng)顆粒（廣東環(huán)球制藥有限公司，批號(hào)161213）；烏苯美司（西安萬(wàn)隆制藥股份有限公司，批號(hào)170308）；虛汗停（廣州白云山奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)17048）。大鼠白細(xì)胞介素4 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠免疫球蛋白A 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠免疫球蛋白G酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠干擾素γ 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為384181016、347181016、349181016、366181016。水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，分析純，批號(hào)2016092901）；環(huán)磷酰胺（德國(guó)Baxter Oncology GmbH 公司，批號(hào)8D232A）。

1.3 儀器 JJ3000-動(dòng)物電子秤（美國(guó)G＆G 公司）；BS224S電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；3K30 離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司）；Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司），F(xiàn)C500 流式細(xì)胞 儀（美國(guó) Beckman Coulter 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 70 只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、烏苯美司 組（2.7 mg／kg）、虛汗停顆粒組（5.4 g／kg）及玉屏風(fēng)顆粒高、中、低劑量組（5.4、2.7、1.35 g／kg）。采用環(huán)磷酰胺建立免疫缺陷模 型［5-6］，按40 mg／kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，首次加倍，隔日1 次，連續(xù)4 次；正常組腹腔注射等劑量的生理鹽水。大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺4 次后灌胃給藥，給藥體積為10 mL／kg，模型組和正常組給予等量生理鹽水，連續(xù)1 個(gè)月。給藥結(jié)束前一天禁食12 h，末次給藥1 h 后取血。

2.2 檢測(cè)大鼠血液中的淋巴細(xì)胞亞群比例、Treg 細(xì)胞比例 采用流式細(xì)胞術(shù)。（1）取50 μL 血樣于各管中，加CD3＋、CD25＋抗體各1 μL，CD4＋抗體1.25 μL，渦旋后避光孵育25 min，加紅細(xì)胞裂解液400 μL 后，避光10 min；（2）于1 500 r／min 離心15 min，去上清；（3）加1 mL 工作液，振勻，室溫避光1 h；（4）加2 mL Permeabilization Buffer，離心后去上清；（5）用100 μL Permeabilization Buffer 重懸細(xì)胞；（6）加Foxp3 ＋抗體1 μL，室溫避光30 min；（7）加2 mL Permeabilization Buffer，離心5 min 去上清；（8）加500 μL 鞘液，充分混勻，上機(jī)檢測(cè)。

2.3 測(cè)定血清中IL-4、IFN-γ、IgG、IgA 水平 用ELISA法檢測(cè)。（1）根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)于96 孔板中加入等量的血清樣品，并依次加入25 μL 生物素標(biāo)記抗體；（2）在標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品孔中分別加入100 μL 辣根過(guò)氧化物，充分混勻，37 ℃溫箱中孵育60 min，清洗液洗板5 次；（3）依照次序于每個(gè)孔中加入TMB Ⅰ50 μL，再加入TMB Ⅱ50 μL，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)20 min；（4）反應(yīng)后每孔加入終止液50 μL，充分反應(yīng)，于450 nm 下讀取吸光度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析和兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。組間比較，方差齊時(shí)采用SNK 法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3 法。

3 結(jié)果

3.1 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血液淋巴細(xì)胞亞群的影響 如表1、圖1 所示，與正常組比較，模型組CD3＋、CD3＋CD8＋比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CD3＋CD4＋、CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比例降低（P＜0.05）；與模型組比較，虛汗停組CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比例升高（P＜0.05），而烏苯美司組、玉屏風(fēng)顆粒組CD3＋CD4＋、CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比例升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血液淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s，n＝10）

表1 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血液淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s，n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血液Treg 細(xì)胞的影響 如表2、圖2 所 示，與正常組比較，模型組CD4＋CD25＋、CD25＋FOXP3＋、CD4＋FOXP3＋比例降低（P＜0.01）；與模型組比較，烏苯美司組CD4＋CD25＋比例升高（P＜0.05），而虛汗停組、玉屏風(fēng)顆粒組3 個(gè)比例均升高（P＜0.01）。

表2 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血液Treg 細(xì)胞的影響（±s，n＝10）

表2 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血液Treg 細(xì)胞的影響（±s，n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血清IL-4、IFN-γ、IgG、IgA 水平的影響 如表3 所示，與正常組比較，模型組IL-4、IgA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但分別呈上升、降低趨勢(shì)，IgG 水平下降，IFN-γ 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，虛汗停組、玉屏風(fēng)顆粒組逆轉(zhuǎn)IgG、IFN-γ 水平（P＜0.01），而烏苯美司組僅IFN-γ 水平下降（P＜0.01）。

表3 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血清IL-4、IgG、IgA、TNF-γ 水平的影響（±s，n＝10）

表3 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠血清IL-4、IgG、IgA、TNF-γ 水平的影響（±s，n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖2 各組大鼠血液中Treg 細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，免疫疾病主要與先天稟賦不足、外感六淫之邪、營(yíng)衛(wèi)氣血失調(diào)、腑臟功能紊亂、痰濁瘀血內(nèi)生等因素密切相關(guān)，故確定“扶正祛邪”這一治則［7］。玉屏風(fēng)散可益氣固表、祛風(fēng)御邪，臨床多用于治療感冒、調(diào)節(jié)免疫力、減少過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，故本實(shí)驗(yàn)選擇該方進(jìn)行研究。

環(huán)磷酰胺是一種細(xì)胞毒性藥物，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，體現(xiàn)在抑制巨噬細(xì)胞活性、抑制T 細(xì)胞增殖及抗體分泌等方面［8］。免疫調(diào)節(jié)以T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，T 淋巴細(xì)胞又可分為輔助性T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，主要表面標(biāo)志分別是CD4 和CD8，CD4＋／CD8＋在維持機(jī)體免疫平衡中有重要意義［9-10］；CD4＋細(xì)胞亞群在體內(nèi)的作用機(jī)制復(fù)雜，其比例升高時(shí)免疫增強(qiáng)，對(duì)炎癥介質(zhì)的釋放也有影響［11-12］；有Th1、Th2、Th3、Th17、Tfh 等，其中Th1細(xì)胞可促進(jìn)IFN-γ 的產(chǎn)生，Th2 細(xì)胞分泌的IL-4 在促進(jìn)B細(xì)胞和肥大細(xì)胞增殖、發(fā)揮巨噬細(xì)胞的功能中均有重要作用［13-14］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細(xì)胞亞群，其中自然調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞主要為CD4＋CD25＋Treg，除表達(dá)CD4、CD25 分子外，其特征標(biāo)志為其高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3［15-17］。

本實(shí)驗(yàn)顯示，玉屏風(fēng)顆粒對(duì)維持機(jī)體免疫平衡、提高免疫力有顯著效果；與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組大鼠血清中IgG 水平升高、IFN-γ 水平降低，且血液中CD4＋、CD8＋、CD4＋CD25＋、FOXP3＋細(xì)胞比例均有上升趨勢(shì)，其作用機(jī)制可能是提升CD4＋、CD8＋、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例，重新平衡和提高淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平，從而維持Th1 和Th2 細(xì)胞的平衡；抑制IFN-γ 分泌，促進(jìn)IgG 產(chǎn)生，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)免疫平衡、增強(qiáng)免疫力的目的。