付莉慧，楊 敏，楊興鑫，俞 捷，賀 森，黃 豐，趙榮華，顧 雯

（云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

特異性皮炎（atopic dermatitis，AD）是以劇烈瘙癢為主要臨床癥狀的慢性炎癥性皮膚病，各年齡段均可發(fā)病，以?xún)和畛Ｒ?jiàn)，且近年來(lái)其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活品質(zhì)［1］。最新研究顯示AD 兒童具有罹患焦慮、抑郁、注意力缺陷多動(dòng)障礙等精神性疾病的傾向，因此，AD 已成為世界范圍內(nèi)人民健康，特別是兒童健康的重大危害［2］。特異性皮炎的治療目前大多采用口服抗組胺藥和外用激素類(lèi)藥膏，但是長(zhǎng)期使用這些藥物存在著許多不利因素［3］。對(duì)葉豆Cassia alataL.是豆科決明屬植物，又名有翅決明、非洲木通，其味辛，性溫，入心、脾二經(jīng)，多外用鮮品，主治神經(jīng)性皮炎、牛皮癬、濕疹、皮膚瘙癢、瘡癤疼痛，是傣族用于治療皮膚病的常用藥［4］。本研究通過(guò)檢測(cè)對(duì)葉豆浸膏對(duì)特異性皮炎模型小鼠的藥效作用，并探討其可能作用機(jī)制，為拓寬相關(guān)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 普通級(jí)6 周齡雌性BALB／c 小鼠54 只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于北京華泵康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥物 對(duì)葉豆浸膏由云南中醫(yī)學(xué)院炮制實(shí)驗(yàn)中心提供。取對(duì)葉豆全葉加10 倍量90%乙醇回流提取1.5 h，濾過(guò)，濾液濃縮至稠膏；藥渣以8 倍量的水煎煮1 h，濾過(guò)，濾液與上述稠膏合并，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.41～1.45，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?% 對(duì)葉豆浸膏濃度由1 g 對(duì)葉豆浸膏加入99 mL 70%乙醇配制而成，10%對(duì)葉豆浸膏由10 g對(duì)葉豆浸膏加入90 mL 70%乙醇配制而成。

1.3 試劑 復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（湖北科田藥業(yè)有限公司，批號(hào)160805）；2，4-二硝基氟苯（成都西亞化工股份有限公司，批號(hào)J01010）；硫化鈉（西隴化工股份有限公司，批號(hào)151204）；乙醇（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)20160927）；IL-4、IL-6、IL-13、IL-16、IL-33、免疫球蛋白E（Ig-E）、TNF-α、IFN-γ ELISA 檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物有限公司，批號(hào)分別為 220470431、220670535、221370512、221660641、223370513、227161244、228270625、228070225）。

1.4 儀器 SpectraMax Plus384 酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；HR／T16 M 高速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥 動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)，在特異性皮炎模型造模方面對(duì)已有方法［5］進(jìn)行了一定的改進(jìn)。將BALB／c 小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陰性對(duì)照組（70%乙醇）、對(duì)葉豆低劑量組（1%）、對(duì)葉豆高劑量組（10%）、陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方醋酸地塞米松乳膏），每組9 只。實(shí)驗(yàn)前1 d，所有小鼠用8%硫化鈉溶液進(jìn)行背部脫毛（2.5 cm×2.5 cm），暴露皮膚；實(shí)驗(yàn)第1、2 天對(duì)除正常組以外的小鼠進(jìn)行造模，即在小鼠背部已脫毛的皮膚上涂抹丙酮-橄欖油混合溶液（3∶1）配置的0.5%2，4-二硝基氟苯溶液，第3～6 天不作任何處理；第7 天開(kāi)始隔天涂抹1 次0.5% 2，4-二硝基氟苯溶液，70 μL／次，共10 次，21 d 后造模完成。正常組背部已脫毛的皮膚僅涂抹丙酮橄欖油混合溶液，涂抹時(shí)間和劑量與造模組一致。造模結(jié)束后陽(yáng)性對(duì)照組涂抹復(fù)方醋酸地塞米松乳膏，對(duì)葉豆低、高劑量組涂抹相應(yīng)劑量浸膏，正常組和模型組涂抹丙酮-橄欖油混合溶液，陰性對(duì)照組（用來(lái)排除70%乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響）涂抹70%乙醇，外涂藥物1 次／d，給藥14 d。

2.2 小鼠局部皮膚組織評(píng)價(jià) 治療第14 天，觀察各組小鼠皮炎情況并拍照記錄。處死小鼠后，用直徑6 mm 打孔器在相同部位取下背部脫毛處的皮膚（不含皮下脂肪）用千分卡尺單盲法測(cè)定皮膚厚度，用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片、HE 染色后10 倍顯微鏡下觀察組織病理改變，單盲法分別計(jì)算10 個(gè)高倍視野真皮炎性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

2.3 小鼠血清細(xì)胞因子水平檢測(cè) 治療第14 天摘除小鼠眼球取血，室溫下靜置30 min，在4 ℃下3 500 r／min 離心15 min，獲取血清。使用ELISA 試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清IL-4、IL-6、IL-13、IL-16、IL-33、TNF-α、IFNγ、IgE 水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)葉豆浸膏對(duì)AD 模型小鼠皮膚組織的影響

3.1.1 小鼠背部皮損情況 正常組小鼠皮膚正常，組織結(jié)構(gòu)基本正常；模型組小鼠皮膚可見(jiàn)紅斑、丘疹、結(jié)痂、糜爛樣等皮膚損傷改變；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠背部皮膚光滑，可見(jiàn)少量的結(jié)痂；對(duì)葉豆低劑量組小鼠背部有紅斑；對(duì)葉豆高劑量組小鼠背部皮膚光滑，皮膚無(wú)明顯糜爛；陰性對(duì)照組小鼠皮膚有少許紅斑糜爛，不光滑。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠背部皮損情況

3.1.2 小鼠背部皮損組織病理 正常組表皮真皮結(jié)構(gòu)正常，真皮層未見(jiàn)血管擴(kuò)張及炎癥細(xì)胞；模型組角化過(guò)度，棘層肥厚明顯伴灶性海綿水腫，真皮血管擴(kuò)張充血較多單核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛囊結(jié)構(gòu)減少；陽(yáng)性對(duì)照組表皮各層較清晰，真皮血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞較模型組明顯減輕，毛囊結(jié)構(gòu)明顯增多；對(duì)葉豆低、高劑量組明顯緩解了炎性細(xì)胞，但是棘層還是較厚，毛囊結(jié)構(gòu)明顯減少；陰性對(duì)照組表皮增厚、細(xì)胞間水腫、表皮和真皮內(nèi)有單核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且較陽(yáng)性對(duì)照組及對(duì)葉豆低、高劑量組炎性浸潤(rùn)更嚴(yán)重。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠背部皮膚HE 染色病理形態(tài)觀察（×10）

3.1.3 小鼠皮膚厚度和炎性細(xì)胞數(shù)的變化 與正常組比較，模型組皮膚真皮浸潤(rùn)炎性細(xì)胞增多、背部皮膚增厚（P＜0.01）；與模型組比較，對(duì)葉豆低、高劑量組均能降低背部皮膚真皮浸潤(rùn)炎性細(xì)胞數(shù)（P＜0.01），說(shuō)明對(duì)葉豆浸膏有一定抗炎、修復(fù)皮膚的作用。見(jiàn)表1。

3.2 對(duì)葉豆浸膏對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組血清IL-16、IL-33、TNF-α、IgE、IL-4、IL-13、IL-6 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，對(duì)葉豆高劑量組IL-33、TNF-α、IgE、IL-4、IL-13、IL-6 水平降低（P＜0.01），低劑量組僅IL-13、IL-6 水平降低（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 各組皮膚厚度及真皮炎性細(xì)胞數(shù)比較（±s，n＝9）

表1 各組皮膚厚度及真皮炎性細(xì)胞數(shù)比較（±s，n＝9）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

AD 是一個(gè)由Th1／Th2 免疫反應(yīng)引發(fā)的雙相性炎性皮膚?。?］，Th1／Th2 細(xì)胞因子之間存在拮抗關(guān)系，IFN-γ 主要是Th1 分泌的細(xì)胞因子，IL-4 及IL-13 主要是Th2 分泌的細(xì)胞因子，Th1／Th2 失衡可以導(dǎo)致過(guò)敏性疾病，Th1／Th2 平衡狀態(tài)對(duì)于保持機(jī)體正常的免疫有重要意義［7］。且目前已知胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素、IL-25、IL-33，特別是IL-33 是激活并促進(jìn)先天性淋巴細(xì)胞（innate lymphoid cells，ILC2s）釋放細(xì)胞因子的主要因子，因此對(duì)AD 的發(fā)病有重要作用［8-9］。ILC2s 被激活后，分泌細(xì)胞因子IL-5、IL-9 和IL-13，其中IL-13 可誘導(dǎo)B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE，間接活化肥大細(xì)胞（Mast cell，MC），IL-5 是嗜酸粒細(xì)胞的強(qiáng)趨化因子和增殖因子，而研究表明MC 在AD 患者皮損部位的數(shù)目多于非皮損部位，因此在AD 作用機(jī)制中，MC 扮演重要角色，而IL-5、IL-9 和IL-13 即是調(diào)控AD 的關(guān)鍵細(xì)胞因子，也對(duì)AD的發(fā)病有重要作用［8-10］，國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)AD 患者IgE 以及T 輔助淋巴細(xì)胞Th2 型細(xì)胞因子水平明顯增高［11］，AD患者為T(mén)h2 占優(yōu)的過(guò)敏性疾病，Th2 分泌的IL-4 可促使B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，Th1 分泌的IFN-γ 強(qiáng)烈抑制IgE 的合成［11］，但不同時(shí)期及不同程度皮損的AD 患者血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平有差別［12］，且在急性和慢性炎癥皮損表達(dá)IL-4、IL-13 的細(xì)胞數(shù)顯著高于正常人［13］。因此，降低AD 患者IgE 水平、抑制Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)，逆轉(zhuǎn)Th2 型免疫反應(yīng)，有望成為AD 治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表2 各組血清炎癥因子水平比較（±s，n＝9）

表2 各組血清炎癥因子水平比較（±s，n＝9）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

本研究中，模型組血清中IgE、IL-6、IL-13、IL-16、TNF-α 水平、皮層厚度、炎性細(xì)胞數(shù)較正常組均升高，而IFN-γ 較正常組水平降低；與模型組相比，在給予對(duì)葉豆浸膏治療后，血清中IgE、IL-33、IL-6、IL-13 水平、皮層厚度、炎性細(xì)胞數(shù)都有明顯下調(diào)，IFN-γ 的表達(dá)量有所增加，即說(shuō)明Th1／Th2 免疫反應(yīng)引發(fā)的雙相性炎性皮膚病，在下調(diào)了Th2 細(xì)胞的分化，同時(shí)激活了Th1 細(xì)胞。提示對(duì)葉豆浸膏治療AD 小鼠的作用機(jī)制可能是，通過(guò)促進(jìn)IFN-γ分泌，降低IL-4 水平，同時(shí)抑制IgE 合成調(diào)節(jié)，Th1 分泌的IFN-γ 和Th2 分泌的IL-4 之間的平衡，使Th1／Th2 趨于平衡而發(fā)揮治療作用。