張建芬，林 璟，徐好儀，張夢(mèng)捷

（浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015）

華澤蘭Eupatorium chinenseL.為菊科澤蘭屬一年生或多年生草本植物，在我國(guó)主要分布于東南部至西南部。傳統(tǒng)藥理研究表明，華澤蘭具有清熱解毒、涼血利咽、抗炎鎮(zhèn)痛等功效；現(xiàn)代研究表明，華澤蘭富含結(jié)構(gòu)新穎的萜類及黃酮類化合物，具有顯著的抑菌和抑制腫瘤細(xì)胞活性［1-3］。劉夢(mèng)元等［4］從華澤蘭根中分離得到苯并呋喃類化合物，具有較強(qiáng)抑菌活性；尉小琴等［5］從華澤蘭中分離得到澤蘭苦內(nèi)酯類化合物，對(duì)人胃癌HGC-27 細(xì)胞及小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒活性。

Stierle 等［6］從短葉紅豆杉Taxus brevifolia中分離到一株能夠產(chǎn)生與宿主相同的抗腫瘤代謝產(chǎn)物紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae，而且從藥用植物內(nèi)生真菌中尋找活性成分成為研究的熱點(diǎn)，大量的抑菌抗腫瘤活性成分從中分離出來(lái)，如紫杉醇、喜樹堿、長(zhǎng)春新堿、鬼臼毒素等［7］。從澤蘭屬中藥內(nèi)生真菌中篩選結(jié)構(gòu)新穎、效價(jià)高、成藥性良好的抑菌、抗腫瘤先導(dǎo)物頗具研究前景，但目前有關(guān)華澤蘭內(nèi)生菌產(chǎn)生抑菌、抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物的研究尚未見報(bào)道。

植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生萜類、生物堿類、芳香類、肽類等活性次生代謝產(chǎn)物，可分為聚酮類和非核糖體多肽類化合物，生物合成過(guò)程分別是在聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）和非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）的催化下完成［8］?；赑KS 和NRPS 功能基因定向篩選的方法，可以預(yù)測(cè)菌株可能產(chǎn)生的化合物類型，發(fā)現(xiàn)新的聚酮類和非核糖體肽類［9］。

本研究以傳統(tǒng)藥用植物華澤蘭為材料，從植物各部位分離內(nèi)生真菌，并利用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合ITS序列分析進(jìn)行內(nèi)生真菌的鑒定；篩選含有PKS 和NRPS 基因的功能菌株，預(yù)測(cè)其產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)活性篩選的方法從中挖掘出具有抑菌、抗腫瘤活性菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 華澤蘭于2016 年9 月至2016年11 月采自杭州西山國(guó)家森林公園，采用隨機(jī)取樣法收集健康植株的根、莖、葉、花，裝入無(wú)菌袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，用于內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 采用PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和純化，采用PDB 培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)，采用康乃馨葉片培養(yǎng)基（CLA）進(jìn)行內(nèi)生真菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)。

1.1.3 試劑 真菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）有限公司；DNA marker 和2×Taq PCR Master mix 均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；PCR 擴(kuò)增引物合成和PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 內(nèi)生真菌分離 采用組織分離法，參照汪瀅等［10］報(bào)道。將健康華澤蘭的根、莖、葉、花用自來(lái)水洗凈，切為小段或小片。分別用75% 乙醇和3%次氯酸鈉溶液消毒2 min，其間分別無(wú)菌水沖洗多次。樣品晾干后，切成約1 cm×1 cm 大小，接到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)。將最后1 次清洗樣品所用無(wú)菌水涂布于PDA 平板上作為對(duì)照，同樣條件下培養(yǎng)、觀察，以確保表面消毒徹底。挑取樣品切口處長(zhǎng)出的菌絲尖端部分，轉(zhuǎn)接至新鮮PDA 培養(yǎng)基上，多次純化培養(yǎng)，直至獲得純菌株。

1.3 內(nèi)生真菌鑒定 觀察內(nèi)生真菌的平板菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)，結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)分離到的真菌進(jìn)行表型鑒定［11］，分子生物學(xué)鑒定參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法［10］。采用CTAB 法提取內(nèi)生真菌的基因組DNA，以此為模板，ITS1、ITS4 為引物，對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST 進(jìn)行比對(duì)分析。采用MEGA5 軟件的Neighbor-Joining（鄰接）法構(gòu)建內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000 次進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

1.4 內(nèi)生真菌PKS 和NRPS 基因檢測(cè)和分析 以內(nèi)生真菌菌株基因組DNA 為模板，按照文獻(xiàn)的方法，采用兼并引物KAF1（5′-GARKSICAYGGIACIGGIAC-3′）、KAR1（5′-CCAYTGIGCICCRTGICCIGARAA-3′）和 AUG003（5′-CCGGCACCACCGGNAARCCHAA-3′）、AUG007（5′-CCGGACCATGTCGCCNGTBYKRTA-3′）進(jìn)行PKS、NRPS 功能基因的PCR 擴(kuò)增［9-10］。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序。利用BLASTx 軟件將獲得的PKS 和NRPS 基因序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列，在線進(jìn)行序列的同源性比對(duì)。

1.5 內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)和活性成分提取 將篩選出的內(nèi)生真菌接種PDB 發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL／500 mL），25 ℃培養(yǎng)7～10 d?；钚猿煞值奶崛⒄瘴墨I(xiàn)［10］報(bào)道的方法，發(fā)酵液用布氏漏斗過(guò)濾。發(fā)酵濾液用等體積乙酸乙酯萃取3 次，收集萃取液45 ℃下減壓濃縮至干，用抑菌、抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。

1.6 抑菌活性測(cè)定 采用濾紙片法。以革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、革蘭氏陰性菌大腸桿菌Escherichia coli、真菌面包酵母Saccharomyces cerevisiae為指示菌，分別吸取測(cè)試樣品溶液（以乙酸乙酯稀釋至10 mg／mL）15 μL 滴加于空白藥敏紙片（直徑6 mm）上，將紙片貼到涂布有0.2 mL指示菌菌液（約1×106CFU／mL）的LB 平板上，以乙酸乙酯為空白對(duì)照，100 μg／mL 氨芐青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定各樣品抑菌圈直徑。

1.7 抗腫瘤活性檢測(cè) 采用MTT 法［5］。以人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 和MCF-7 為檢測(cè)瘤株，完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞在96 孔板中培養(yǎng)后，于490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A），計(jì)算IC50。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生真菌的分離與鑒定 采用平板分離法，從華澤蘭中分離得到內(nèi)生真菌43 株。根據(jù)內(nèi)生真菌菌株的平板菌落形態(tài)特征和顯微鏡下的形態(tài)特征，去重后共得到內(nèi)生真菌8 株。

在PDA 培養(yǎng)基上，部分菌株的菌落形態(tài)見圖1、表1。各菌株的菌落形態(tài)豐富，有絨毛狀、絮狀、花瓣?duì)?，顏色有白色、粉紅色、紅色、黑色、綠色等；有的菌株生長(zhǎng)較快，菌絲發(fā)達(dá)，有的生長(zhǎng)較慢。圖1 表明，EC2、EC7、EC8 菌株生長(zhǎng)較快，菌絲發(fā)達(dá)，迅速長(zhǎng)滿整個(gè)平板，而EC4、EC9 生長(zhǎng)較慢。

圖1 部分內(nèi)生真菌形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics on some entophytic fungi

以華澤蘭內(nèi)生真菌的基因組DNA 為模板，以ITS1 和ITS4 為引物，成功擴(kuò)增了其ITS 區(qū)序列，測(cè)序結(jié)果提交GeneBank 經(jīng)Blast 比對(duì)分析和進(jìn)化樹分析，基于ITS 區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖2。由此可知，8 株菌株分別與Fusarium graminearum、Diaporthesp、Alternaria alternata、Fusarium prolif-eratum、Neofusicoccumparvum、Alternaria tenuissima、Phyllosticta capitalensis的親緣關(guān)系最近（序列相似度98% 以上），將其ITS 區(qū)序列提交Genbank，獲得登錄 號(hào)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和5.8SrDNA／ITS 區(qū)序列分析結(jié)果，菌株EC102、EC103 鑒定為禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum（GeneBank 登陸號(hào)MK243482 和MK243483）；菌株EC104 鑒定為間座殼屬Diaporthesp（GeneBank 登陸號(hào)MK243484）；菌株EC105 鑒定為鏈格孢屬Alternaria alternata（GeneBank 登陸號(hào)MK243485）；菌株 EC107 鑒定為層生鐮刀菌Fusarium proliferatum（GeneBank 登陸號(hào)MK243486）；菌株EC108 鑒定為葡萄座腔菌屬小新殼梭孢Neofusicoccum parvum（GeneBank 登陸號(hào)MK243487）；菌株EC109 鑒定為細(xì)極鏈格孢Alternaria tenuissima（GeneBank 登陸號(hào)MK243488）；菌株 EC111 鑒定為首都葉點(diǎn)霉屬Phyllosticta capitalensis（GeneBank 登陸號(hào)MK243489）。

表1 內(nèi)生真菌表型鑒定Tab.1 Phenotype identification of entophytic fungi

圖2 內(nèi)生真菌18S rRNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylognetic tree of entophytic fungi 18s rRNA sequence

2.2 NRPS 和PKS 基因分析 華澤蘭內(nèi)生菌株的NRPS 和PKS 基因擴(kuò)增電泳圖見圖3，可見產(chǎn)物條帶在600～700 bp 左右。本研究共得到了3 個(gè)NRPS 基因片段，占總量的37.5%；1 個(gè)PKS 基因片段，占總量的12.5%。將測(cè)序得到的NRPS 和PKS 基因片段用BLAST 比對(duì)，結(jié)果見表2，可知NRPS 片段與GenBank 中已知NRPS 序列的相似度并不高，僅為70%～83%，表明對(duì)分離到8 株菌株的NRPS 和PKS 基因研究較少。因此，對(duì)其深入探討將有可能發(fā)現(xiàn)新型聚酮類和非核糖體多肽類化合物。

圖3 部分菌株的PKS 和NRPS 基因擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PKS and NRPS gene amplication of some strains

2.3 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性 對(duì)分離純化得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯提取后，分別得到華澤蘭內(nèi)生真菌乙酸乙酯提取物，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和面包酵母作為指示菌，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果見表3，表明菌株EC102、EC103、EC107、EC108、EC111 對(duì)供試的4 株菌株都有較好的抑菌效果，占總分離菌株的50%；EC104 和EC109 只對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用；EC108 和EC109 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到22 mm。

表2 NRPS 和PKS 基因的相似菌株及相似度Tab.2 Similar strains and similarities of NRPS and PKS genes

表3 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性（±s）Tab.3 Antimicrobial activities of fermentation broth of endophytic fungi（±s）

表3 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性（±s）Tab.3 Antimicrobial activities of fermentation broth of endophytic fungi（±s）

2.4 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性 將內(nèi)生真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物作用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 進(jìn)行抗腫瘤試驗(yàn)，結(jié)果見表4。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，在96 孔板培養(yǎng)物中具有抑制效果的細(xì)胞不同程度脫落、變形甚至凋亡；8株菌株的乙酸乙酯提取物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDAMB-231 均有不同程度的抗腫瘤活性，其中效果最明顯的是EC102、EC108，其次是EC107、EC109。然后，將EC102、EC107、EC108、EC109 乙酸乙酯提取物作用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們均有不同程度的抗腫瘤活性，其中效果最好的是EC109。綜合抑菌實(shí)驗(yàn)和抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌株EC102、EC107、EC108、EC109 的代謝產(chǎn)物同時(shí)具有抑菌和抗腫瘤活性。

表4 內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)MDA-MB-231 和MCF-7 的抑制活性（±s）Tab.4 Inhibitory activities of fermentation broth of endophytic fungi to MDA-MB-231 and MCF-7（±s）

表4 內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)MDA-MB-231 和MCF-7 的抑制活性（±s）Tab.4 Inhibitory activities of fermentation broth of endophytic fungi to MDA-MB-231 and MCF-7（±s）

3 討論

藥用植物具有非常豐富的內(nèi)生真菌資源，而澤蘭屬植物內(nèi)生真菌的研究主要集中在入侵植物紫莖澤蘭Eupatorium adenophorum上。本研究首次從華澤蘭中分離得到8 株植物內(nèi)生菌，分析了華澤蘭內(nèi)生真菌的NRPS 和PKS 基因，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)NRPS 基因片段和1 個(gè)PKS 基因片段。目前對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌PKS 和NRPS 的研究相對(duì)較少，研究華澤蘭中兩者有助于發(fā)現(xiàn)新的聚酮類和非核糖體肽類化合物。

抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明，菌株EC102、EC103、EC107、EC108、EC111 對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、面包酵母都具有很好的抑菌活性；抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，它們對(duì)2 種腫瘤細(xì)胞株均有不同程度的抗腫瘤活性，其中效果最好的是EC102、EC108 乙酸乙酯提取物，兩者代謝產(chǎn)物同時(shí)具有較強(qiáng)的抑菌、體外抗腫瘤作用。研究表明，鐮刀菌屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物通常會(huì)具有較好的抑菌活性和抗腫瘤活性［12-15］，盧圍等［13］從小花棘豆中分離到鐮刀菌Fusarium proliferatum，能產(chǎn)抗腫瘤活性物質(zhì)苦馬豆 素；鄭里翔等［14］發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌Fusariumsp.JN 158 所產(chǎn)色素對(duì)MCF-7 乳腺癌細(xì)胞有明顯抑制作用；劉雷等［15］從川麥冬中分離得到鐮刀菌屬內(nèi)生真菌，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等有抑制作用；Ratnaweera 等［16］從仙人掌中分離得到內(nèi)生真菌Fusariumsp 的代謝產(chǎn)物，具有抑菌作用。但有關(guān)葡萄座腔菌屬代謝產(chǎn)物抗菌抗腫瘤的研究報(bào)道較少，故可進(jìn)一步研究菌株EC102、EC108 代謝產(chǎn)物中抗菌、抗腫瘤活性成分的組成及其結(jié)構(gòu)，探明這些內(nèi)生真菌是否產(chǎn)生與宿主華澤蘭相同或相似的萜類及黃酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物，或是新的活性物質(zhì)，以期為抗腫瘤、抗菌藥物的開發(fā)提供參考。