張世洋，劉美辰，唐 飛，王 晶，敖 慧

（成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137）

慢性萎縮性胃炎是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，具有病因多、病程長、反復發(fā)作、易生癌變等特點［1］。中醫(yī)認為，慢性萎縮性胃炎屬于“胃脘痛”“痞滿”“吐酸”“嘈雜”等范疇，脾胃氣虛為其基本病機［2］。人參、白術是臨床常用的健脾益氣相須藥對，主治脾胃氣虛諸證［3］，臨床研究表明，以人參、白術為核心藥對的方藥（如四君子湯等）治療慢性萎縮性胃炎效果確切［4］，且多數(shù)方中兩者比例為1∶1，如四君子湯、參苓白術散等，其中人參的主要活性成分為人參皂苷和人參多糖，白術的有效成分為白術多糖和白術揮發(fā)油。課題組前期證實，人參、白術有效組分群能有效緩解慢性萎縮性胃炎［5］，但其機制尚未完全揭示。

隨著“人類微生物組計劃”進行到第二階段［6］，菌群對于人類健康的影響越來越受到人們的重視，研究菌群對機體的作用也逐漸成為近年來的熱點。相關研究發(fā)現(xiàn)，菌群可影響宿主的發(fā)育、生理功能、免疫功能、能量代謝、營養(yǎng)狀態(tài)等［7-9］。慢性萎縮性胃炎作為一種消化系統(tǒng)的疾病，常伴有泛酸、嘔吐的癥狀，會對腸道及口腔的菌群產(chǎn)生影響，目前相關文獻較少，主要集中于舌苔及胃內(nèi)［10-12］，未見同時對口腔及腸道菌群的研究。本研究采用16S rDNA 探究人參白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔及腸道菌群的影響，從菌群的角度探討人參白術有效組分群治療慢性萎縮性胃炎的作用，為進一步開發(fā)人參、白術藥對提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，雌雄均有，體質(zhì)量180～220 g，購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2013-15。實驗程序嚴格按照動物管理章程。

1.2 試劑與藥物 白術、人參購于成都國際商貿(mào)城，由成都中醫(yī)藥大學藥學院陳璐副教授鑒定分別為五加科植物人參Panax gingsengC.A.Meyer 的干燥根、菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖。1-甲基-3-硝基-1-亞硝基-胍（東京化成工業(yè)株式會社，批號NH8JH-DR）；羧甲基纖維素鈉（成都市科龍化工試劑廠，批號2014033101）；無水硫酸鈉（成都市科龍化工試劑廠，批號2015051801）。無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠，批號2016082501）；水為純水。

1.3 儀器 HX-200 型高速中藥粉碎機（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；Sartorius BP211D AG 電子天平（德國賽多利斯公司）；ZDHW-1000 電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；K850 臨界點干燥儀（英國Quorum 公司）；E-1045 離子濺射裝置（日本株式會社日立高新技術事務所）；Inspect 掃描電子顯微鏡（美國FEI 公司）；Illumina HiSeq 測序平臺。

2 方法

2.1 人參、白術有效部位提取

2.1.1 人參皂苷提取 稱取900 g 人參粉末，加8倍量60%乙醇回流提取3 次，2 h／次，合并3 次濾液，回收乙醇至無醇味，過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至流出液無顏色后，70%乙醇洗脫至流出液無顏色為止，收集流出液，減壓濃縮至無醇味，80 ℃下烘干得粗品。

2.1.2 人參多糖提取 稱取900 g 人參粉末，加10 倍水回流提取3 次，2 h／次，合并3 次濾液，低溫冷置12 h，濾過，濃縮，加95% 乙醇至含醇量達60%，低溫冷置12 h，離心，取沉淀，加適量水后進行2 次醇沉，烘干得粗品。

2.1.3 白術多糖提取 稱取900 g 白術粉末，按“2.1.2”項下方法操作。

2.1.4 白術揮發(fā)油提取 稱取900 g 白術粉末，裝入水蒸氣蒸餾提取器中，加入8 倍量蒸餾水，用電熱套加熱至微沸，提取8 h，收集蒸餾液，加入適量無水硫酸鈉，除去下部蒸餾水得油狀提取物，密封后置于4 ℃冰箱中保存。

2.1.5 藥物制備 計算各有效部位提取物的生藥量，根據(jù)人參、白術在四君子湯中各9 g 的劑量，將配伍比例設定為1∶1。按生藥量比例進行折算，分別稱取人參皂苷30 g、人參多糖35.17 g、白術多糖20.77 g、白術揮發(fā)油3.17 mL，溶于含0.1%羧甲基纖維素鈉的蒸餾水中，配制成每1 mL 含0.15 g 人參生藥、0.15 g白術生藥的混合液備用。

2.2 造模、分組及給藥 取SD 大鼠，隨機分成空白組、模型組、給藥組。除空白組外，用主動免疫法復制脾虛慢性萎縮性胃炎模型［13］，以蒸餾水配制166.67 mg／L 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基-胍替代飲用水，自由飲食，在造模第50、70 天隨機抽取模型大鼠，進行胃組織病理學檢測，判定模型復制情況。造模70 d 后，給藥組給予每1 mL 含0.15 g 人參生藥、0.15 g 白術生藥的混合液，大鼠給藥體積為1 mL／100 g，1 次／d，連續(xù)60 d，末日處死大鼠，取胃組織、口腔唾液及糞便保存。

2.3 胃黏膜組織病理學檢查 胃組織以10%福爾馬林溶液固定，進行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色，按炎癥活動性程度分為0 分，正常；1 分，少量淋巴細胞和漿細胞浸潤，累及固有膜淺層上1／3；2 分，多灶性炎細胞浸潤，炎癥累計固有膜以下達2／3；3 分，大量炎細胞浸潤，呈灶性分布達2／3；4 分，彌漫性炎細胞浸潤，甚至膿腫形成達2／3，伴腸化水腫。以萎縮性程度（黏膜固有層固有腺體的減少）作為評分指標，每項分為0 分，正常；1～2 為輕度，1 分，僅胃竇部表層有少量腺體變形，細胞變小，2 分，胃竇部淺層腺體呈局灶性萎縮，減少，達腺體上1／3，大小彎腺體正常；3 分為中度，胃竇及大小彎腺體均有萎縮減少，達腺體中2／3；4 分為重度，胃竇部大部分萎縮減少，僅殘留少數(shù)原有腺體，大小彎腺體萎縮或黏膜顯著變薄，原有腺體完全萎縮、消失，代之以化生腺體。

2.4 胃黏膜掃描電鏡檢查 胃組織用PBS 洗滌2次，5 min／次，用4%蔗糖溶液洗滌1 次，時間為5 min，酒精脫水（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每梯度10 min）。將樣本輕輕粘在導電膠上，臨界點干燥，真空噴鍍，最后在鏡下選擇合適位置，適當倍數(shù)進行觀察。

2.5 菌群樣本DNA 的提取及16SrDNA 測序 采用SDS 方法對樣本的基因組DNA 進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量樣品DNA 于離心管中，無菌水稀釋至1 ng／μL，以稀釋后的基因組DNA 為模板，PCR 擴增16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)（341 正向5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806 反向 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），PCR 產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 2%瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，剪切回收目標條帶。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒進行文庫的構建，經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL 進行上機測序。

以Shannon 指數(shù)和ACE 指數(shù)對菌群多樣性及豐度進行描述。Shannon 指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)，計算公式為其中S表示總的物種數(shù)，Pi表示第i個物種占總數(shù)的比例；ACE 指數(shù)是生態(tài)學中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，計算公式為其中Sabund是樣本中出現(xiàn)超過10 次的物種的數(shù)目，Srare是出現(xiàn)不多于10 次的物種的數(shù)目，CACE表示所有低豐度（出現(xiàn)≤10 次）的物種中非單個種類的比例，F(xiàn)i為含有i條序列的OTU 數(shù)目為變異系數(shù)。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，微生物多樣性、豐度和菌群門、屬水平上的差異均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法；等級資料數(shù)據(jù)組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗分析，相關性分析采用Spearman Rank 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 胃黏膜層組織病理改變 空白組胃黏膜腺管排列整齊，形狀大小一致，呈單柱狀；壁細胞、主細胞界限清楚，壁細胞體積較大，胞漿嗜酸性，核小而圓；主細胞呈錐狀或柱狀，核圓；壁細胞固有層內(nèi)胃腺體排列緊密整齊，未見或少見炎性細胞，黏膜下層無水腫。模型組黏膜層厚度較正常變薄，黏膜固有層腺體松散，體積減小，數(shù)量減少，細胞成分趨向單一，壁細胞、主細胞等明顯減少；間質(zhì)成分相對增多，累及黏膜全層的炎細胞浸潤，以淋巴細胞和漿細胞為主。與模型組比較，給藥組病理結果均有改善，腺管排列趨向整齊，黏膜固有層腺體數(shù)量增加，固有層炎癥細胞數(shù)目減少，見圖1。與模型組比較，給藥組可抑制胃黏膜腺體萎縮，等級分布下降，胃組織病理學檢查評分降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠慢性萎縮性胃炎病理評分（±s，n＝8）Tab.1 Pathological scores for rats of chronic atrophic gastritis among various groups（±s，n＝8）

表1 各組大鼠慢性萎縮性胃炎病理評分（±s，n＝8）Tab.1 Pathological scores for rats of chronic atrophic gastritis among various groups（±s，n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 胃掃描電鏡觀察 胃黏膜掃描電鏡結果顯示，空白組大鼠胃黏膜上皮細胞緊密相連，被縱橫交錯的小溝分隔成許多胃小區(qū)，呈網(wǎng)眼狀，胃小凹排列整齊，大小均勻一致。模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)皺襞隆起，表面粗糙，腺腔間黏膜變寬，胃小凹變形，大小不一，小凹壁上皮細胞萎縮，上皮廣泛破潰、脫落。與模型組比較，給藥組胃小凹形狀大小趨向規(guī)則，萎縮程度得到緩解，有少量破潰。見圖2。

圖1 各組大鼠胃組織病理學變化（HE，×100）Fig.1 Histopathological changes of rat stomach among various group（HE，×100）

圖2 各組大鼠胃黏膜掃描電鏡觀察（×1 000）Fig.2 Scanning electron microscopic observation of gastric mucosa of rats among various groups（×1 000）

3.3 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道微生物多樣性的影響 慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道微生物多樣性具有同樣的變化趨勢，與空白組比較，模型組Shannon 指數(shù)下降（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組Shannon 指數(shù)上升（P＜0.05）。與空白組比較，模型組大鼠口腔、腸道微生物均出現(xiàn)多樣性減少，給予人參、白術有效組分群治療后其口腔、腸道微生物多樣性得到一定程度恢復。見圖3。

圖3 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道菌群Shannon 指數(shù)的影響（n＝6）Fig.3 Effects of key effective components of GRAMR on Shannon index in oral and intestinal flora of rats with chronic atrophic gastritis（n＝6）

3.4 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道微生物豐度的影響 慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道微生物菌群豐度具有同樣的變化趨勢，與空白組比較，模型組 ACE 指數(shù)下降（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組ACE 指數(shù)上升（P＜0.05）。與空白組比較，模型組大鼠口腔、腸道微生物均出現(xiàn)菌群豐度減少，給予人參、白術有效組分群治療后其口腔、腸道微生物菌群豐度得到一定程度恢復。見圖4。

圖4 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道菌群ACE 指數(shù)的影響（n＝6）Fig.4 Effects of key effective components of GRAMR on ACE index in oral and intestinal flora of rats with chronic atrophic gastritis（n＝6）

3.5 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道菌群門水平的影響 3 組大鼠腸道菌群序列主要分屬于擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門；與空白組比較，模型組擬桿菌門、螺旋體門的比例下降，厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門的比例升高，給藥組以上菌群門比例逆轉（圖5A）。3 組大鼠口腔菌群序列主要分屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門；與空白組比較，模型組變形菌門、放線菌門、酸桿菌門的比例下降，梭桿菌門的比例升高，給藥組以上菌群門比例逆轉（圖5B）。與模型組比較，給予人參、白術有效組分群治療后，口腔、腸道梭桿菌門的比例降低（P＜0.05），見圖6。

圖5 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道菌群門水平的影響（n＝6）Fig.5 Effects of key effective components of GRAMR on phylum levels of oral and intestinal flora in rats with chronic atrophic gastritis（n＝6）

圖6 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道梭桿菌門的影響（n＝6）Fig.6 Effects of key effective components of GRAMR on oral and intestinal fusobacteria of rats with chronic atrophic gastritis（n＝6）

3.6 人參、白術有效組分群對慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道菌群屬水平的影響 在腸道菌群中，與空白組比較，模型組普雷沃氏菌屬＿9、普雷沃氏菌科＿UCG-001 的比例下降，給藥后上升；模型組普雷沃氏菌科＿UCG-003、厭氧螺菌屬、羅斯氏菌屬的比例升高，給藥后下降，以普雷沃氏菌科＿UCG-003 更明顯（P＜0.05）。見圖7A、圖8A。

在口腔菌群中，與空白組比較，模型組葉桿菌屬、奈瑟氏菌屬、擬桿菌屬、普拉梭菌屬、普雷沃氏菌科＿UCG-003 的比例下降，給藥后上升；模型組不動桿菌屬、梭桿菌屬的比例升高，給藥后下降，以梭桿菌屬更明顯（P＜0.05）。見圖7B、圖8B。

圖7 人參、白術有效組分群治療慢性萎縮性胃炎大鼠后其口腔、腸道菌群屬水平比較（n＝6）Fig.7 Effects of key effective components of GRAMR on genus levels of oral and intestinal flora in rats with chronic atrophic gastritis（n＝6）

圖8 人參、白術有效組分群治療慢性萎縮性胃炎大鼠后其口腔、腸道菌群屬水平比較（n＝6）Fig.8 Effects of key effective components of GRAMR on genus levers in oral and intestinal flora in rats with chronic atrophic gastritis（n＝6）

3.7 人參、白術有效組分群治療慢性萎縮性胃炎作用與口腔、腸道菌群相關性 大鼠炎癥活動性程度和萎縮性程度與口腔和腸道菌群的豐度、多樣性，以及門、屬水平上的差異菌相關。見表2。

表2 大鼠慢性萎縮性胃炎病理評分與菌群相關性Tab.2 Correlation between pathological score and microflora of rats with chronic atrophic gastritis

4 討論

慢性萎縮性胃炎屬于胃癌前病變的一個重要階段［14］，多年來一直是消化道疾病領域研究熱點。本實驗通過主動免疫法復制大鼠慢性萎縮性胃炎，發(fā)現(xiàn)在病變過程中胃黏膜腺體出現(xiàn)萎縮，炎癥浸潤明顯，電鏡掃描表明模型組大鼠胃小凹變形，胃黏膜皺襞隆起；經(jīng)人參、白術有效組分群治療后，胃黏膜的萎縮程度及炎癥程度得到顯著改善，說明該有效部位群治療慢性萎縮性胃炎療效確切。

本研究通過16S rDNA 高通量測序技術對大鼠口腔、腸道菌群進行了測定，16S rDNA分子大小適中、突變率小，序列具有保守性和普遍性，是細菌系統(tǒng)分類學研究中最常用的手段［15］，可克服傳統(tǒng)體外分離培養(yǎng)技術種群丟失、種群結構不清等局限［16］。相關性分析結果顯示，大鼠病理學炎性評分與其口腔和腸道菌群的豐度、多樣性，以及門、屬水平上的差異菌相關。與空白組比較，慢性萎縮性胃炎大鼠口腔、腸道菌群的多樣性及豐度均顯著降低；經(jīng)人參、白術有效組分群治療后均顯著升高，提示它可恢復大鼠口腔、腸道菌群的多樣性及豐度。

與空白組比較，在門水平上模型組大鼠口腔、腸道中的梭桿菌門均上升，人參、白術有效部位群治療后下降；模型組大鼠口腔菌群中梭桿菌門的比例升高，而經(jīng)人參、白術有效部位群治療后下降。在屬水平上，模型組大鼠腸道菌群中普雷沃氏菌科＿UCG-003的比例升高，人參、白術有效部位群治療后下降。模型組大鼠口腔、腸道菌群與空白組比較，菌群結構發(fā)生了變化，經(jīng)人參、白術有效部位群治療后得到一定恢復。梭桿菌中具核梭桿菌是口腔常見細菌，最初被認為是益生菌，現(xiàn)代研究表明其具有很強致病性，能引起多種口腔疾病，如牙周炎、牙髓炎、根尖周炎等［17-19］；在消化道方面，具核梭桿菌被證明與腸道癌癥密切相關，可在結直腸腫瘤中高度富集［20］，并隨結腸腫瘤的擴散而遷移［21］，還可通過與腫瘤細胞表面的特定抗體結合的方式提高結直腸癌的復發(fā)率［22］。另外，普雷沃氏菌的升高則被證明與強直性脊柱炎有關［23］。由此推測，人參、白術治療慢性萎縮性胃炎的機制可能與降低這些致病菌的比例相關。

綜上所述，人參、白術有效組分群可顯著改善大鼠胃黏膜萎縮程度及炎癥水平，對慢性萎縮性胃炎具有緩解作用，并在一定程度上逆轉口腔、腸道菌群下降的豐度和多樣性，減少腸道、口腔中致病菌。本實驗為人參、白術藥對治療慢性萎縮性胃炎的臨床應用提供了科學依據(jù)，并證實其藥效與其改善腸道、口腔微生態(tài)有一定關系。