陳新，陸慧，葛勇勝，莢衛(wèi)東

（安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院 肝臟外科/肝膽胰外科安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230001）

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥，同時也是全球癌癥死亡的第四大原因，每年約有841000例 新發(fā)病例和782000例死亡[1]。其中，70%～90%的原發(fā)性肝癌是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），大約50%的HCC新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在中國。近年來，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，已成為世界范圍關(guān)注的健康問題。據(jù)報道[2-3]，HCC的5年生存率僅為15%～40%。根治性肝切除仍然是現(xiàn)階段提高HCC生存率的有效方法，同時肝癌的系統(tǒng)治療已經(jīng)進入靶向治療和免疫治療的進程，索拉非尼、侖伐替尼及納武單抗等相繼被批準用于晚期肝癌一線及二線治療[4-6]，鑒于此，尋找HCC 的有效的治療靶點以及對術(shù)后生存時間評估，探究與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后相關(guān)的腫瘤生物學指標具有一定的臨床意義。膠質(zhì)細胞成熟因子β（glia maturation factor β，GMFB）是一種17 kDa、高度保守的腦蛋白，其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化誘導劑，具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護功能[7]。GMFB通過磷酸化途徑參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)[8]。近年來研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤、乳腺癌和卵巢癌等中GMFB高表達且與預后不良密切相關(guān)。Ki-67廣泛存在于細胞有絲分裂的除G0外的各個時期，全面地反映細胞的增殖活性，并可指導乳腺癌、宮頸癌、肺癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)歸及預后[12-13]。然而，HCC中GMFB與Ki-67表達相關(guān)性以及GMFB與臨床病理資料間的關(guān)系目前國內(nèi)外鮮有報道，本研究從GMFB的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)水平檢測其在HCC組織中的表達，并探究GMFB與Ki-67在HCC的表達相關(guān)性及GMFB表達與HCC患者相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2012年1月—2016年12月安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院肝臟外科行根治性肝切除術(shù)的91例HCC 組織及對應(yīng)的癌旁組織（距離癌組織邊緣 ＞2 cm）石蠟切片，臨床病理資料包括患者性別、年齡、有無HBV感染、AFP、腫瘤數(shù)目、肝硬化、微血管侵犯（MVI）、Edmondson分級、BCLC分期以及隨訪資料。91例患者中男77例，女14例；年齡32～87歲，平均59歲；Edmondson分級I～II級63例、III～IV級28例；BCLC分期A～B期者27例，C～D期者64例。隨訪時間截止至2019年2月，所有患者均電話隨訪，失訪率14%。另外收集2018年11月—2019年4月于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院肝臟外科因HCC行肝切除術(shù)的患者的新鮮冷凍HCC組織及其配對癌旁組織36對，-80 ℃保存。石蠟組織切片及新鮮標本病理診斷均為HCC，所有病例術(shù)前均未接受放化療、中醫(yī)等治療。本研究資料獲得患者及家屬知情同意及安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院臨床試驗倫理委員會批準（倫理批件號2017倫審第114號）。

1.2 主要試劑

兔抗人多克隆抗體GMFB（美國Proteintech公司）；兔抗人多克隆抗體Ki-67（美國Proteintech公司）；新型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒（福州邁新公司）；蘇木素染色劑（北京中杉金橋公司）；TRIzol試劑（美國Thermo公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司），qRT-PCR引物（上海擎科生物公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 qRT-PCR 從HCC 與癌旁組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行PCR 擴增，一式三份進行。引物由上海擎科生物公司合成，GMFB 引物序列正向：5'-ATG TTG CCG AAG ATT TAG TGG AA-3'， 反向：5'-CCA CCA GGC GTT TAT CCT TG T-3，內(nèi)參設(shè)置18 s，引物序列正向：5'-CGG CGA CGA CCC ATT CGA AC-3'，反向：5'-GAA TCG AAC CCT GAT TCC CCG TC-3'；反應(yīng)條件：94 ℃變性10 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共34 個循環(huán)，表達水平通過2-ΔΔCt方法分析。

1.3.2 Western blot 將36 對新鮮冷凍HCC 組織及其配對癌旁組織裂解后提取總蛋白，Bradford 法定量蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)各樣品蛋白質(zhì)濃度一致后加樣，每孔30 μg，電泳分離，轉(zhuǎn)至NC 膜上，含5% 脫脂奶粉的洗滌緩沖液室溫下于搖床中封閉1 h，加入GMFB 抗體（1:1000）和內(nèi)參蛋白GAPDH 抗體（1:1000），4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加二抗（1:1000）室溫孵育2 h，再次洗膜后顯影，采用Tanon 5200 Imaging System捕獲印跡，使用Image-J 軟件分析GMFB 蛋白和內(nèi)參蛋白GAPDH 的灰度值，根據(jù)目標蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值計算GMFB 的相對表達量。

1.3.3 免疫組化 采用免疫組化SP 法對91 例HCC 及癌旁組織中GMFB 和Ki-67 的表達情況進行檢測，石蠟包埋標本4 μm 切片，在65 ℃烤箱中烘烤20 min，二甲苯脫蠟后經(jīng)100%、95%、75% 梯度乙醇水化，PBS 漂洗后以檸檬酸鈉緩沖液pH（6.0）高壓容器中加熱至沸騰，高壓閥門噴氣持續(xù)3 min 完成抗原修復。過氧化氫室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 沖洗3 次，每次3 min；加入兔抗人GMFB 多克隆抗體（1:300）/兔抗人多克隆抗體Ki-67（1:8000）后室溫孵育2 h，PBS 沖洗后加入二抗，室溫孵育30 min后PBS 沖洗，顯微鏡控制下DAB 顯色，最后蘇木素復染，自來水沖洗后藍化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.3.4 結(jié)果判讀 GMFB 蛋白主要定位于細胞質(zhì)中，部分細胞核可見著色，Ki-67 蛋白主要定位于細胞核中，染色區(qū)域呈現(xiàn)出彌漫性棕黃色或黃褐色。免疫組化結(jié)果通過半定量法評估[11]，高倍鏡下取5 個視野觀察陽性著色細胞所占區(qū)域百分比，記分：0 分（0～4%）；1 分（5%～24%）；2 分（25%～49%）；3 分（50%～74%）或4 分（75%～100%）。染色的強度分級如下：0 分，陰性；1 分，弱；2 分，中等或3 分，強。通過將2 個得分相乘得到最終得分為 0 到12 分。將得分＞5 分視為陽性表達，否則為陰性表達。每張切片的結(jié)果均由兩位經(jīng)驗豐富的病理科主治醫(yī)師采用雙盲法進行判讀。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 21.0及Graph Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。qRT-PCR及Western blot結(jié)果為計量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示；采用χ2檢驗分析GMFB表達與患者臨床病理資料間的關(guān)系，并以Spearman等級相關(guān)分析兩因素間的相關(guān)性。通過Kaplan-Meier方法繪制無病生存期（DFS）和總生存期（OS）曲線，并作Log-rank檢驗。Cox回歸模型用于分析GMFB的表達與患者臨床病理參數(shù)等多因素與HCC預后的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC 及癌旁組織GMFB mRNA 表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，36對標本中的28 對GMFB在HCC組織中mRNA的表達量高于對應(yīng)的癌旁組織。GMFB mRNA在HCC組織中的相對表達量為1.67±0.72，癌旁組織中的相對表達量為1.00±0.51，差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.595，P＜0.001）（圖1）。

圖1 qRT-PCR 檢測GMFB mRNA 的表達Figure1 Detection of GMFB mRNA expression by qRT-PCR

2.2 HCC 及癌旁組織GMFB 蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示，36對新鮮標本中的27對GMFB蛋白在HCC組織中的表達量高于對應(yīng)的癌旁組織。GMFB蛋白在HCC組織中的相對表達量為1.54±0.65，癌旁組織中的相對表達量為0.90±0.55，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.579，P＜0.001）（圖2）。

圖2 Western blot 檢測GMFB 蛋白表達Figure2 Detection of GMFB protein expression by Western blot analysis

2.3 GMFB 與Ki-67 在HCC 中的表達的相關(guān)性

GMFB主要定位于細胞質(zhì)中，部分切片可見核質(zhì)均表達，Ki-67主要定位于細胞核中，呈現(xiàn)彌漫性棕黃色或黃褐色，兩者在HCC中的表達均顯著高于對應(yīng)的癌旁組織（圖3）。91例HCC組織中GMFB、Ki-67的陽性率分別為70.33%（64/91）、67.03%（61/91），癌旁組織陽性表達率分別為21.98%（20/91）、19.78%（18/91），兩者在HCC組織與癌旁組織中的陽性表達率差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=42.803，P＜0.001；χ2=41.357，P＜0.001）（表1）。

圖3 免疫組化檢測GMFB、Ki-67 的表達（×400） Figure3 Immunohistochemical staining for GMFB and Ki-67 expressions (×400)

表1 GMFB與Ki-67蛋白在HCC及癌旁組織的表達[n（%）]Table1 Expressions of GMFB and Ki-67 protein in HCC and adjacent tissues [n (%)]

2.4 GMFB 的表達與臨床病理特征的關(guān)系

GMFB 表達上調(diào)與HCC 腫瘤MVI（P=0.045）、Edmondson分級（P=0.032）及BCLC分期（P=0.012）明顯有關(guān)。在合并MVI組（49/64，76.56%）GMFB表達明顯高于無MVI組（15/27，55.56%），Edmondson分級III～IV級組（24/28，85.71%）GMFB表達高于I～II級組（40/63，63.49%），BCLC分期C～D期（50/64，78.13%）組GMFB表達同樣高于A～B 期組（14/27，51.85%），而與性別、年齡、有無HBV感染、血清AFP水平、腫瘤數(shù)目及是否合并肝硬化無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表2）。

表2 GMFB 表達與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table2 Relations of GMFB expression and clinicopathological features of the patients [n (%)]

2.5 GMFB、Ki-67 在HCC 中表達的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析顯示，GMFB、Ki-67在HCC 組織中的表達呈明顯正相關(guān)（rs=0.265，P＜0.05）（表3）。

表3 GMFB 與Ki-67 在HCC 組織中表達的相關(guān)性[n（%）]Table3 Correlation between expressions of GMFB and Ki-67 in HCC tissue [n(%)]

2.6 生存分析

Kaplan-Meier生存分析顯示，GMFB陽性表達的HCC患者的DFS（平均4.52個月）較GMFB陰性表達的HCC患者的DFS（平均10.48個月）明顯降低（P=0.001）；GMFB陽性表達的HCC患者的OS（平均27.67個月）較GMFB陰性表達的HCC患者的OS（平均39.75個月）明顯降低（P=0.007）。Cox單因素回歸分析顯示，患者DFS與OS均與BCLC分期、Ki-67表達、GMFB表達明顯有關(guān)，而MVI與患者OS明顯有關(guān)（均P＜0.05）（表4）；進一步行Cox多因素回歸分析顯示，Ki-67與GMFB在HCC中高表達是HCC患者預后的獨立危險因素（均P＜0.05）（表5）。

表4 HCC 患者預后因素的單變量分析Table4 Univariate analysis of prognostic factors for HCC patients

表5 HCC 患者預后因素的多因素分析Table5 Multivariate analysis of prognostic factors for HCC patients

3 討 論

HCC的治療方式主要包括根治性肝切除、局部消融、TACE、肝移植、放射治療以及全身治療等[14]。對于難治性中晚期HCC的治療需要以上治療方式相輔相成、綜合性治療。隨著SHARP和Oriental兩大研究的成功開展[4-5]，索拉非尼開啟了晚期HCC靶向治療新時代，尋求有效的治療靶點成為了研究熱點。人類GMFB基因位于人14號染色體的長臂上，有6個內(nèi)含子和7個外顯子，純化的GMFB蛋白具有142個氨基酸殘基。研究表明，GMFB可以在細胞內(nèi)和細胞外充當信號分子，并且可以通過自分泌或旁分泌方式影響信號轉(zhuǎn)導以及細胞通訊[15]。隨著研究的深入，多項研究發(fā)現(xiàn)GMFB在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。Yamazaki等[16]證實了胸腺瘤亞型中GMFB的顯著高表達，并發(fā)現(xiàn)了GMFB通過誘導淋巴上皮間的相互作用在胸腺瘤的T細胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Li等[11]通過免疫組織化學技術(shù)分析了246例卵巢病變揭示了GMFB在漿液性卵巢癌組織中的GMFB表達上調(diào)，并證實了表達明顯高于正常上皮、良性漿液性腺瘤和交界性漿液性腺瘤組織，通過Cox單因素和多因素回歸模型分析漿液性卵巢癌中GMFB高表達與DFS和OS的關(guān)系，提出GMFB可以被當作漿液性卵巢癌患者預后和生存的預測因子。Kuang等[9]應(yīng)用GMFB和CD31的免疫組織化學雙重染色，發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)母細胞瘤細胞中GMFB的過表達通過引發(fā)惡性膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)皮化過程促進新生血管形成，還通過敲低U87細胞中GMFB的表達發(fā)現(xiàn)抑制了膠質(zhì)母細胞瘤U87細胞的增殖及小管的形成。與此同時，GMFB是一種細胞內(nèi)源性蛋白，參與細胞信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)。星形膠質(zhì)細胞中GMFB的表達可能導致p38 MAPK的激活，隨后激活NF-κB，最后導致GM-CSF和Cu-Zn SOD的表達，導致一些促炎細胞因子的過度表達及參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)[17-18]。通過基因感染神經(jīng)母細胞瘤N18細胞中過表達GMFB誘導GSK-3β激活介導的胱天蛋白酶依賴的細胞凋 亡[19]。Nwosu等[20]研究所得到HCC代謝靶點中篩選出GMFB基因，但目前關(guān)于GMFB在HCC中的表達的研究鮮有報道，與臨床病理資料及患者預后間的關(guān)系未見闡述。

本研究通過Westernblot、qRT-PCR 檢測GMFB在36對HCC及配對的癌旁組織中的表達，收集HCC及癌旁組織石蠟切片91例以免疫組化方式檢測GMFB和Ki-67的表達，并分析兩者表達的相關(guān)性，結(jié)果均顯示GMFB在HCC中表達顯著高于癌旁組織，Spearman相關(guān)分析GMFB表達與反映細胞增殖的Ki-67的表達顯著相關(guān)。另外分析GMFB的表達與患者相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系及與患者預后間的關(guān)系，臨床病理資料分析顯示表達上調(diào)的GMFB與HCC腫瘤MVI、Edmondson分級及BCLC分期顯著相關(guān)（P=0.045、P=0.032、P=0.012），MVI是術(shù)后早期復發(fā)的重要臨床病理特征，可以作為一種重要的預后風險因素[21-22]，因此，GMFB在預測術(shù)后復發(fā)和臨床預后等方面值得進一步研究。同時，該研究通過Kaplan-Meier分析，結(jié)果表明GMFB表達上調(diào)組的無病生存期與總生存期較GMFB較低表達組明顯縮短，多因素Cox回歸模型表明上調(diào)的GMFB是HCC患者預后的獨立危險因素。這表明GMFB可能對HCC的發(fā)生、發(fā)展有一定的意義。Ki-67是細胞增殖的標志物，對細胞周期的具有重要的影響，研究顯示Ki-67高表達提示乳腺癌、消化道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、星形細胞瘤的預后不佳，高表達的Ki-67在HCC中提示腫瘤術(shù)后復發(fā)風險增加[23-24]，本研究中GMFB表達與Ki-67表達顯著相關(guān)，參考以往報道[8]，過表達GMFB在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)皮化過程中促進新血管形成，表明GMFB與HCC的增殖相關(guān)?，F(xiàn)階段靶向治療藥物主要通過抑制腫瘤細胞增殖及抗血管生成發(fā)揮作用，血管生成與免疫抑制構(gòu)成了血管的微環(huán)境，GMFB的表達可能與腫瘤血管生成相關(guān)。

綜上所述，本研究揭示了GMFB mRNA及蛋白在HCC中的表達情況，進一步分析GMFB的表達與臨床病理資料之間的相關(guān)性，得到GMFB可能會在HCC的預測早期復發(fā)和患者臨床預后的預測中發(fā)揮作用，具有一定的臨床應(yīng)用價值。當然，GMFB在HCC發(fā)生發(fā)展中作用的具體機制仍需要進一步探索。小樣本及單中心研究具有一定的局限性，進一步深入研究GMFB在HCC靶向治療聯(lián)合免疫治療是未來的研究方向，GMFB有可能成為HCC系統(tǒng)治療新的位點。

志謝：特別感謝中國科學技術(shù)大學生命科學院中國科學院先天免疫與慢性病重點實驗室的技術(shù)支持、患者及其家屬的知情同意以及安徽省立醫(yī)院倫理委員會的批準。