張寶華

（朔州師范高等?？茖W(xué)校，山西朔州 036000）

1 PCR技術(shù)原理

PCR指的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），而PCR技術(shù)就是一種將待檢驗(yàn)的DNA序列于生物體細(xì)胞外在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)方法。對于PCR技術(shù)，主要由3個(gè)反復(fù)循環(huán)的步驟構(gòu)成，也就是高溫變性、低溫退火以及適溫延伸，然后在TaqDAN聚合酶這種特異的耐熱酶的催化作用下完成。對于PCR技術(shù)的基本原理，是將寡聚核苷酸引物與模板DNA分子結(jié)合，然后進(jìn)行特異核苷酸序列的擴(kuò)增。

2 PCR技術(shù)的主要分類

2.1 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，對于多重PCR技術(shù)的原理，和PCR技術(shù)大致相同，是加入兩對及以上的特異性引物在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，而由于引物能夠特異性結(jié)合模板DNA，所以在同一模板不同區(qū)的多個(gè)目的或是多個(gè)模板的NDA片段能夠擴(kuò)增出來。對于多重PCR技術(shù)，具有低成本、高效率、簡單省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，在其基于引物篩選的基礎(chǔ)上需要多次優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

2.2 單分子PCR技術(shù)

單分子PCR技術(shù)是以單個(gè)或者是少量的DNA分子作為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。和傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，單分子PCR技術(shù)的基本循環(huán)過程相同，只不過在模板數(shù)量、引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件以及DNA聚合酶的選擇等方面，單分子PCR技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)都不相同。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

所謂的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上融合核酸擴(kuò)增、雜交、實(shí)時(shí)檢測以及光譜分析等技術(shù)，因此具有準(zhǔn)確性高以及實(shí)時(shí)性的特點(diǎn)。對于PCR技術(shù)的研究，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是從定性到定量的飛躍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是由美國PE公司于1995年研制成功的，然后將其應(yīng)用到了植物生物學(xué)、分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。

3 PCR技術(shù)在植物生物學(xué)中的應(yīng)用

3.1 PCR技術(shù)在植物抗病基因檢測中的應(yīng)用

隨著社會的不斷進(jìn)步，科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對于植物抗性基因的檢測越來越關(guān)注，而對于基因的表達(dá)量差異，采用傳統(tǒng)的諾瑟雜交或者是常規(guī)PCR方法，很難將其快速、準(zhǔn)確地分析出來，而通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，能夠?qū)χ参镌诓煌幚項(xiàng)l件下基因的表達(dá)量差異進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析。除此之外，對于抗病基因，還能夠使用多重PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。

2005年，李君明等[1]使用多重PCR技術(shù)對抗番茄花葉病毒病的Tm 22基因以及番茄抗根結(jié)線蟲的Mi基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增篩選，擴(kuò)增的特異性片段基本完全吻合待引物擴(kuò)增片段，然后再通過酶切對感病基因型和雜純合基因型進(jìn)行鑒別。多重PCR技術(shù)能夠在同一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)篩選鑒定兩個(gè)抗病基因并早期輔助選育苗期。2012年，陳濤等[2]利用與抗白粉病基因Pm13和Pm21連鎖的特異性標(biāo)記，將含有抗白粉病基因Pm13和Pm21的114株雜交F4代群體隨機(jī)挑選，進(jìn)行單一PCR和多重PCR技術(shù)檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有Pm21特異標(biāo)記的有5株，具有Pm13特異標(biāo)記的有4株，同時(shí)具有Pm13和Pm21特異標(biāo)記的有4株，兩者具有一致的檢測結(jié)果。該研究同時(shí)表明對于Pm13和Pm21，多重PCR檢測能夠?qū)⒑羞@兩個(gè)抗病基因的累加體材料快速、準(zhǔn)確地檢測出來。2013年，劉超勤等[3]在對抗根結(jié)線蟲病的Mi基因、抗黃化曲葉病毒病的Ty-1和Ty-2基因以及抗葉霉病Cf-5基因緊密連鎖的CAPS標(biāo)記進(jìn)行的篩選中，只使用了一次多重PCR技術(shù)，然后通過酶切后得到的特異性片段大小與他人的結(jié)果基本相同，這表明了多重PCR技術(shù)的準(zhǔn)確性較高。

3.2 PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物檢測中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因作物面積的增加，雖然解決了人類的溫飽問題，但相應(yīng)的也帶來了新的問題，比如對人類健康產(chǎn)生的影響等問題。隨著對基因工程認(rèn)知的逐漸深入，人們對于轉(zhuǎn)基因食品的安全性也越來越重視，因此就需要對轉(zhuǎn)基因植物的定量以及定性檢測技術(shù)進(jìn)行加強(qiáng)。PCR定量分析技術(shù)能夠在不進(jìn)行電泳的情況下快速、高效地獲取轉(zhuǎn)基因成分的準(zhǔn)確含量。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能夠同時(shí)在致病菌以及轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中使用，而多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物的鑒定中也有著重要的作用。

2002年，Colono等[4]在基于兩對引物的PCR技術(shù)中對PAT基因和CryIA基因進(jìn)行同時(shí)檢測，成功地區(qū)分出轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米。2006年，王志純等[5]建立的3種轉(zhuǎn)基因成分以及馬鈴薯內(nèi)源PATA基因之間的多重PCR技術(shù)，能夠特異性地檢測馬鈴薯及其制品轉(zhuǎn)基因成分。2009年，王渭霞等[6]采用瓊脂糖凝膠電泳和四重PCR擴(kuò)增技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻中Bt、NOS、CpTi以及CaMV35S等常用的外源基因進(jìn)行了快速準(zhǔn)確的檢測；2013年，邱良焱等[7]將轉(zhuǎn)Bt、Bar基因的雙抗稻米作為原料，采用多重PCR檢測體系對水稻內(nèi)源基因SPS和外源基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，之后利用該體系成功地將原料中全部6條目標(biāo)基因快速檢測出來。

3.3 PCR技術(shù)在植物病原物檢測中的應(yīng)用

對于病原物的分離鑒定是十分困難的，尤其是專性寄生菌，另外病原物的毒性表達(dá)與環(huán)境條件有著較大的影響。對于病原微生物的檢測，PCR技術(shù)是對某一特定的引物進(jìn)行選擇，然后擴(kuò)增到相應(yīng)的DNA片段上。

2010年，譚小勇等[8]建立的三重PCR體系擴(kuò)增出 615 bp、480 bp 以及 945 bp 的特異性片段能夠?qū)ο憬妒敳《尽ⅫS瓜花葉病毒以及香蕉線條病毒進(jìn)行同時(shí)檢測，且具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。而在2011年，趙芹等[9]以番木瓜環(huán)斑病毒、小西葫蘆黃花葉病毒以及黃瓜花葉病毒的外殼蛋白基因保守區(qū)序列對特異引物進(jìn)行了設(shè)計(jì)，然后對單一PCR技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了同時(shí)能夠?qū)?種病毒進(jìn)行檢測的多重PCR體系，從而能夠快速、準(zhǔn)確地對其進(jìn)行檢測。

3.4 PCR技術(shù)在植物育種上的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，育種學(xué)家逐漸將PCR技術(shù)運(yùn)用到植物的育種之中。

2003年，馮翠蓮等[10]對康乃馨ACC氧化酶基因的反義植物表達(dá)載體進(jìn)行了構(gòu)建，然后將載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到了康乃馨栽培品之中，獲得了3株轉(zhuǎn)基因植株，然后對其進(jìn)行PCR-Southern和多重PCR檢測，對康乃馨ACC氧化酶反義基因整合到康乃馨基因組中進(jìn)行了證實(shí)，得到了插瓶壽命得以延長的康乃馨新品種。除此之外，張曉科[11]在2007年使用現(xiàn)有小麥品質(zhì)形狀基因的分子進(jìn)行標(biāo)記，從而建立了3個(gè)多重PCR體系，并通過已知形狀的品種對其進(jìn)行驗(yàn)證，而其中多重PCR體系Ⅰ能夠運(yùn)用于一般小麥品質(zhì)分子的育種，從而使選育材料的整體加工水平得到提高；體系Ⅱ能夠運(yùn)用于強(qiáng)筋小麥品種的選育；體系Ⅲ能夠運(yùn)用于糯小麥或者是淀粉品質(zhì)的選育。對于各個(gè)體系之中的引物，其間并不存在錯(cuò)配以及相互抑制，所以其檢測結(jié)果具有可靠性。通過使用這3個(gè)多重PCR體系，能夠使小麥品種的評價(jià)以及選育的效率得到有效提高。另外，鄭寒等[12]在2009年利用對小麥優(yōu)質(zhì)亞基的特異性分子標(biāo)記構(gòu)建多重PCR體系，該體系對于這些亞基的鑒定具有成本低、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。

4 PCR技術(shù)在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用前景

采用分子方法對植物進(jìn)行研究，是近年來植物生物學(xué)研究的重要發(fā)展階段，而其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與多重PCR技術(shù)較單一PCR技術(shù)具有更大的優(yōu)越性，能夠更為有效、準(zhǔn)確地對植物基因進(jìn)行檢測鑒定，因此已經(jīng)廣泛地在植物病理檢疫、植物育種以及環(huán)境對植物基因的表達(dá)影響等方面進(jìn)行應(yīng)用。

多重PCR技術(shù)是在同一個(gè)體系中復(fù)合擴(kuò)增，所以在植物生物學(xué)中會存在一定的問題缺陷，比如與非靶序列的結(jié)合會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增或存在多對引物之間的相互抑制等。所以應(yīng)用多重PCR技術(shù)時(shí)，應(yīng)當(dāng)合理設(shè)計(jì)引物，對多重PCR體系及其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化從而減少非特異性擴(kuò)增。除此之外，還有研究者會使用條件完全相同的成熟單一PCR反應(yīng)，并遵循多重PCR試驗(yàn)引物組合的一般原則，取得了良好的結(jié)果，這就有效避免了多重PCR反應(yīng)體系建立時(shí)繁瑣的優(yōu)化試驗(yàn)，也使得多重PCR技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用范圍得到了極大程度的拓展。

隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，其他技術(shù)與PCR技術(shù)的結(jié)合也逐漸增多，比如將毛細(xì)管電泳技術(shù)與多重PCR技術(shù)相結(jié)合，可以使基因分裂效率以及檢測的準(zhǔn)確度得到有效的提高；另外四色熒光技術(shù)與多重PCR技術(shù)的結(jié)合能夠使檢測的靈敏度得到提高，同時(shí)縮短檢測時(shí)間。而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和生物技術(shù)的不斷研發(fā)，PCR技術(shù)也將得到越來越廣泛的應(yīng)用。