劉亞琴綜述，曹濟(jì)民審校

0 引 言

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域中[1]。納米二氧化硅(silica nanoparticles, SiNPs)作為目前生產(chǎn)應(yīng)用最多的納米材料，其本身具有熱穩(wěn)定性、化學(xué)惰性、高親水性和弱滲透性等獨(dú)特的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于抗微生物制劑的開發(fā)、食品安全檢查、寄生蟲診斷、分子探針、生物成像診斷和腫瘤治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中[2-10]。人工合成的SiNPs可通過皮膚直接接觸、呼吸道吸入、消化道攝入等途徑進(jìn)入相關(guān)職業(yè)人群和接觸人群體內(nèi)，也可通過生物實(shí)驗(yàn)或醫(yī)療途徑進(jìn)入動(dòng)物或人體體內(nèi)。由于納米材料(包括SiNPs)本身結(jié)構(gòu)功能的活躍性，納米材料的生物安全性及納米毒理學(xué)研究對(duì)納米科技的發(fā)展和應(yīng)用顯得尤為重要。充分認(rèn)識(shí)SiNPs具體的毒性作用和機(jī)制可為將來納米顆粒的安全性研發(fā)提供理論依據(jù)。本文從SiNPs在細(xì)胞水平和動(dòng)物整體水平的毒性作用、影響毒性作用的因素和作用機(jī)制等方面作一綜述，籍以為SiNPs的臨床藥物的研發(fā)及其應(yīng)用生物安全性提供參考。

1 SiNPs的毒性作用

細(xì)胞是機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。SiNPs對(duì)多種細(xì)胞都有較明顯的毒性作用。在細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面，SiNPs破壞大鼠心肌細(xì)胞系(H9C2細(xì)胞)的細(xì)胞間隙連接，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這種毒性作用呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性[11]。在細(xì)胞功能方面，Guerrero等[12]通過觀察SiNPs與急性分離的成年大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，SiNPs能降低心肌細(xì)胞收縮頻率和肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶的活性，并抑制線粒體膜電位，從而使細(xì)胞ATP供應(yīng)障礙。Kundu等[13]發(fā)現(xiàn)SiNPs可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中的COX-2表達(dá)。SiNPs通過作用于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的瞬時(shí)感受器電位通道使細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平明顯增高[14]。

SiNPs可通過皮膚、呼吸道和消化道等多個(gè)途徑進(jìn)入生物機(jī)體，并在多個(gè)器官中蓄積，引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。Nemmer等[15]通過小鼠腹腔內(nèi)注射粒徑50 nm 的SiNPs，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)心臟、肝、肺等多種器官內(nèi)超氧自由基(reactive oxygen species, ROS)升高、炎癥發(fā)生及DNA損傷，尤其是引起心臟中TNF-α的升高。Chen等[16]觀察了SiNPs對(duì)不同年齡段大鼠心血管的影響，發(fā)現(xiàn)SiNPs可致心肌缺血性損傷、房室傳導(dǎo)阻滯、纖維蛋白原濃度和血液黏度增加，且老齡鼠對(duì)SiNPs的敏感性比年輕和成年大鼠更高。Duan等[17-19]通過靜脈內(nèi)顯微注射，發(fā)現(xiàn)SiNPs對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的多種器官均有毒性作用，并使斑馬魚器官發(fā)育異常，如出現(xiàn)心臟畸形。以上研究說明SiNPs在細(xì)胞和整體動(dòng)物水平均有毒性作用，并且其毒性作用與SiNPs的粒徑大小、表面修飾方式及暴露劑量密切相關(guān)，也與作用的細(xì)胞或生物種類相關(guān)。因此明確SiNPs對(duì)不同細(xì)胞和生物的作用特點(diǎn)和機(jī)制，對(duì)深入了解SiNPs的生物安全性差異以及如何合理生物利用SiNPs至關(guān)重要。

2 SiNPs的毒性作用機(jī)制

2.1 氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激是納米材料常見的毒性作用機(jī)制，也是較為關(guān)鍵的作用路徑。SiNPs本身具有高反應(yīng)性和高生物活性，其通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞損傷。細(xì)胞水平研究表明，SiNPs作用于HaCaT細(xì)胞系、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)ROS升高，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA損傷，這種效應(yīng)并與SiNPs粒徑和劑量相關(guān)[13, 20-22]；其中在HaCaT細(xì)胞中SiNPs作用于ROS介導(dǎo)的上游激酶，使Akt/Src和JAK2的磷酸化激活STAT3信號(hào)途徑，從而誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量-時(shí)間效應(yīng)。Guo等[23]通過將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)系與SiNPs共孵育24 h后發(fā)現(xiàn)，SiNPs使丙二醛(malondialdehyde, MDA) 、超氧化物羥化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量明顯增加，使谷胱甘肽過氧化物酶含量下降；SiNPs可激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2 related factor 2, Nrf2)介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)，使Nrf2及其關(guān)鍵下游基因的mRNA表達(dá)上調(diào)。SiNP在氧化型低密度脂蛋白刺激后可增強(qiáng)其本身的細(xì)胞毒性，促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)聚集，從而表現(xiàn)出更明顯的細(xì)胞毒性[24]。Hozayen等[25]報(bào)道，介孔納米二氧化硅(mesoporous silica nanoparticles, MSN)通過過量產(chǎn)生ROS，抑制抗氧化劑的作用，促進(jìn)炎癥和組織損傷，從而誘導(dǎo)心臟毒性和肺毒性。

Yu等[26]報(bào)道，將徑粒65nm的SiNPs通過鼠尾靜脈注射于小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)SiNPs通過氧化應(yīng)激途徑激活了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路使肝臟纖維化，并使肝臟組織進(jìn)一步出現(xiàn)凋亡壞死，這種效應(yīng)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。Wu等[27]通過給大鼠氣管滴注徑粒15 nm的SiNPs，發(fā)現(xiàn)SiNPs可時(shí)間和劑量依賴性地致大腦紋狀體和海馬中ROS明顯蓄積，腦組織中H2O2、GSH、SOD和MDA的含量明顯增加并出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，SiNPs通過不同途徑進(jìn)入生物體均可引起多個(gè)臟器發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.2 炎性反應(yīng)進(jìn)入生物體的SiNPs可引起炎癥反應(yīng)，炎癥可使部分細(xì)胞變性、壞死，從而引起生物機(jī)體機(jī)能發(fā)生改變。Guo等[28]通過將SiNPs與Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SiNPs可改變這些細(xì)胞的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平，并引發(fā)炎癥反應(yīng)，IL-8和TNFα表達(dá)上調(diào)；活性氧物質(zhì)的增加說明炎癥的發(fā)生與氧化應(yīng)激有關(guān)。吸入性SiNPs使海馬神經(jīng)元炎性因子IL-1β、IL-6和COX-2明顯增加，并呈現(xiàn)出系統(tǒng)性炎癥[29]。SiNPs誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的心臟炎性改變，同時(shí)使心臟收縮標(biāo)記蛋白肌鈣蛋白T表達(dá)明顯下調(diào)，說明SiNPs通過中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的心臟炎癥和收縮蛋白下調(diào)，從而使心功能下降[19]。

Guo等[23]通過將HUVECs與SiNPs共孵育24 h后發(fā)現(xiàn)，SiNPs使細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 和 MCP-1上調(diào)。Uemura等[30]將SiNPs與RAW264.7細(xì)胞系共孵育時(shí)，僅表現(xiàn)為TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)增加，細(xì)胞內(nèi)ROS無明顯改變，說明SiNPs所引起的炎癥反應(yīng)不僅僅是氧化應(yīng)激所致，也與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變有關(guān)[31]。Yang等[19]將SiNPs與RAW264.7細(xì)胞共孵育后，顯示SiNPs通過激活NLRP3炎性小體使細(xì)胞分泌炎性因子；同時(shí)SiNPs被吞噬進(jìn)入細(xì)胞后進(jìn)一步促使炎癥的發(fā)生。以上研究均顯示SiNPs可使生物體炎癥反應(yīng)發(fā)生的危險(xiǎn)性增加，炎癥反應(yīng)是其引發(fā)生物毒性的機(jī)制之一。

2.3 線粒體損傷線粒體是大多數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生能量的主要場所，也是細(xì)胞中活性氧的主要來源，所以線粒體損傷可引起細(xì)胞或機(jī)體發(fā)生功能性障礙。SiNPs可使心肌細(xì)胞線粒體膜電位改變，使細(xì)胞ATP供應(yīng)障礙，從而引起心肌細(xì)胞功能障礙。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)SiNPs與小鼠精母細(xì)胞系共孵育后發(fā)現(xiàn)，SiNPs使線粒體腫脹，線粒體結(jié)構(gòu)損傷，線粒體嵴出現(xiàn)斷裂并逐漸消失，從而使ATP生成障礙，這種效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。Du等[33]通過氣管灌注粒徑60 nm的SiNPs，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯異常，并通過線粒體途徑激活caspase-3蛋白，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。

2.4 DNA損傷作為細(xì)胞遺傳信息的攜帶者，DNA損傷必然會(huì)引起細(xì)胞功能障礙，從而呈現(xiàn)相應(yīng)的表型。SiNPs通過使細(xì)胞骨架紊亂，可直接破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，使組蛋白磷酸化，從而使DNA無法正常發(fā)揮功能。SiNPs可直接使細(xì)胞核結(jié)構(gòu)破壞，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡[34]。人腸Caco-2細(xì)胞系暴露于SiNPs后，雖在細(xì)胞核中無明顯SiNPs顆粒聚集，但細(xì)胞內(nèi)DNA明顯損傷，并呈現(xiàn)出濃度依賴性[35]。SiNPs可通過激活PKC信號(hào)通路使細(xì)胞停留在G0-G1期，出現(xiàn)異常有絲分裂，并最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。

2.5 其他機(jī)制SiNPs可使多種細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡。Wu等[36]發(fā)現(xiàn)SiNPs能進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞并在其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常和細(xì)胞器損傷；SiNPs暴露增加了兩種ER應(yīng)激標(biāo)記物BiP和CHOP的表達(dá)水平，并使細(xì)胞凋亡。SiNPs使LN229細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物GRP78、GRP94和DDIT3的水平增加，以及IL1B和COX2基因表達(dá)顯著上調(diào)，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是SiNPs的毒性機(jī)制之一[37]，SiNPs也可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起細(xì)胞凋亡。Yang等[38]發(fā)現(xiàn)，SiNPs可通過影響鉀通道而抑制HUVECs活性，但SiNPs影響鉀通道的機(jī)制尚未完全明確。SiNPs還激活內(nèi)皮和周皮細(xì)胞的自噬活動(dòng)，減弱細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，干擾內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，最終抑制血管生成。SiNPs導(dǎo)致年輕成年小鼠的情緒功能障礙和認(rèn)知功能障礙，并通過ERK激活引起神經(jīng)退行性病變和突觸改變[29]。低劑量SiNPs能使肝出現(xiàn)肉芽腫，并逐漸出現(xiàn)纖維化，并在多個(gè)器官(肝、心臟、肺)均出現(xiàn)肥大細(xì)胞聚集[39]。

總之，SiNPs的毒性作用機(jī)制呈現(xiàn)多樣化形式，這在評(píng)價(jià)SiNPs的毒性作用時(shí)需特別注意，以免遺漏有關(guān)作用，造成判斷失誤。

3 影響SiNPs毒性作用的因素

3.1 粒徑納米顆粒粒徑是影響其毒性作用的重要因素。Zhou等[40]將4種粒徑(15、25、50、100 nm)的SiNPs與HUVECs共孵育后發(fā)現(xiàn)，SiNPs引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高，粒徑越小，ROS升高越明顯。將SiNPs通過鼠尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，粒徑(10、30、50、70、100、300、1000 nm)大小與血小板減少、肝損傷和致死毒性之間呈負(fù)相關(guān)；但50 nm SiNPs誘導(dǎo)低體溫效應(yīng)最為明顯[41]。Lee等[42]發(fā)現(xiàn)，20 nm和50 nm兩種粒徑的SiNPs誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡途徑截然不同，粒徑20 nm的SiNPs通過ER應(yīng)激途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而50 nm SiNPs通過P13K/AKT/eNOS信號(hào)軸誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而發(fā)生凋亡。此外，SiNPs的粒徑影響其是否被皮膚吸收，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[43]。

3.2 表面修飾SiNPs因?yàn)榛瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定使得表面易修飾，從而被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域中。有研究發(fā)現(xiàn)，表面修飾無孔和有孔SiNPs作為載體進(jìn)行靶向藥物轉(zhuǎn)運(yùn)治療中具有重要作用[44]。Giovannini等[45]通過穩(wěn)定性更好的水凝膠SiNPs和普通SiNPs分別作用于人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和小雞體循環(huán)發(fā)現(xiàn)，水凝膠SiNPs具有更好的生物相容性，同時(shí)并無明顯血栓形成或致死情況的發(fā)生。非致死顆粒的表面修飾可以在暴露的生物體內(nèi)的多個(gè)器官中產(chǎn)生不同的毒性結(jié)果。甘氨酸功能化SiNPs以類似于可溶性甘氨酸的方式影響斑馬魚胚胎死亡率，發(fā)現(xiàn)兩種SiNPs均可使胚胎大腦、心臟和肝等器官損傷，使得斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷[46]。

3.3 其他因素SiNPs毒性作用受納米顆粒結(jié)構(gòu)形態(tài)、暴露方式、暴露劑量等多種因素影響。而SiNPs本身有晶體和不定形兩種結(jié)構(gòu)，可根據(jù)用途經(jīng)過不同的合成方法合成多種結(jié)構(gòu)。而暴露途徑的不同主要作用的器官也略有不同。呼吸道途徑主要作用于肺[47]，而通過消化道和靜脈注射進(jìn)入機(jī)體主要的靶器官是心臟、肝和脾[26]。

SiNPs毒性作用影響因素繁多，合理設(shè)計(jì)SiNPs的粒徑及表面修飾是安全應(yīng)用SiNPs的基礎(chǔ)，同時(shí)應(yīng)提高生物利用率從而減少暴露劑量。

4 展 望

綜合以上毒性作用和作用機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，SiNPs雖因其結(jié)構(gòu)和效應(yīng)的特殊性而被廣泛應(yīng)用，MSN甚至被應(yīng)用于藥物載體的研究，但對(duì)其生物安全性的評(píng)價(jià)目前仍不充分，因而不容被忽視。目前針對(duì)SiNPs的毒性作用研究，均證實(shí)SiNPs可以使生物體的多個(gè)系統(tǒng)，如免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等發(fā)生功能紊亂；部分作用機(jī)制及影響毒性效應(yīng)的因素已得到較好的闡釋，如SiNPs的粒徑大小、所帶電荷以及修飾方式均可影響毒性作用。進(jìn)一步探討SiNPs毒性作用的靶點(diǎn)，以便為后期更好地防治SiNPs毒性事件的發(fā)生提供理論依據(jù)。SiNPs通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的復(fù)雜路徑及被溶酶體降解的過程還需進(jìn)一步研究，這可為SiNPs作為納米藥物載體提供詳細(xì)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)路徑，為后期臨床應(yīng)用提供更為精準(zhǔn)的方案，同時(shí)為是否通過改變納米顆粒的粒徑及修飾方式來找到一個(gè)低毒性甚至無毒性的納米顆粒提供參考，以便更好應(yīng)用到醫(yī)療和日常生活中。