姚麗娜，王慶，王巧文，張俊玲

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，河北 唐山）

0 引言

肺炎支原體是近幾十年來兒童常見的呼吸道感染病原，多見于社區(qū)獲得性感染，主要發(fā)生在兒童和青年成人[1]。近幾年，我國(guó)兒童的肺炎支原體病例數(shù)逐漸增加，占社區(qū)獲得性肺炎的10%-30%[2]，大環(huán)內(nèi)酯類單一治療效果不佳，肺大葉實(shí)變，累計(jì)肺內(nèi)、肺外系統(tǒng)的重癥支原體肺炎病例數(shù)逐漸增多，預(yù)后較差[3]。目前支原體肺炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)指出，免疫機(jī)制在支原體感染肺部損害過程中發(fā)揮重要作用[4]。1996 年，Lemaitre 等人發(fā)現(xiàn)Toll 受體在成年果蠅先天免疫抗真菌感染機(jī)制中發(fā)揮重要作用，繼而Beutler 研究團(tuán)隊(duì)在哺乳動(dòng)物中亦檢測(cè)出相似的TLR4 受體，之后研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物TLR3、TLR5 等受體[5]。Toll 樣受體（toll-likerceptors）位于前哨細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）[1]，是歸屬于模式識(shí)別受體（The pathogen recognition receptors）的大家族，連接先天及后天免疫[6]，其激活導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、抗原呈遞分子和共刺激分子的誘導(dǎo)[7]。探索調(diào)控MP 致病的機(jī)制，可能為尋求治療支原體肺炎的新方法提供理論基礎(chǔ)和研究方向。本研究采用RT-PCR 方法檢測(cè)TLR-2、TLR-4mRNA 在支原體肺炎患兒外周血單核細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，旨在探討TOLL 樣受體在支原體感染過程中免疫介導(dǎo)的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

支原體肺炎組：病例選自2018 年11 月至2019 年3 月在唐山市婦幼保健院兒科住院的支原體肺炎患兒共114 例，其中男65 例，女49 例。平均年齡(3.72±0.89) 歲，所有病人入組均參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第8 版中MPP 診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中MPP 入組標(biāo)準(zhǔn)[8-10]：具備發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、肺部啰音等呼吸道表現(xiàn)，伴胸部影像學(xué)單側(cè)或雙側(cè)異常改變，并出現(xiàn)肺炎支原體特異性IgM 抗體陽(yáng)性（采用微粒子凝集法，急性期滴度＞1：80 為陽(yáng)性）。SMPP 組入組標(biāo)準(zhǔn)[11-12]：患兒除滿足MPP 診斷標(biāo)準(zhǔn)外，需滿足以下任意標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療1 周后，仍高熱持續(xù)超過10d，且劇烈咳嗽；②影像學(xué)顯示單側(cè)或者雙側(cè)肺大葉高密度肺實(shí)變，或者雙側(cè)間質(zhì)性彌漫性肺浸潤(rùn)，胸腔大量積液，甚至壞死性肺炎；③炎癥指標(biāo)C反應(yīng)蛋白≥40mg/L，中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)超出正常上限；④合并心肌、肝臟等臟器損害。健康對(duì)照組：選取同期我院兒保科體檢的50 例健康小兒為對(duì)照組，男30 例，女20 例，平均年齡(3.85±1.26)歲，無心臟、肝臟、腎臟以及腫瘤等嚴(yán)重疾病者；無先天性畸形者，近期無感染病史。

1.2 方法

1.2.1 采集SMPP 組患兒入院當(dāng)天( 即急性期) 靜脈血2mL，普通MPP 組患兒入院當(dāng)天(即急性期)靜脈血2mL，體檢時(shí)采集健康兒童外周血2mL，于-4℃冰箱保存。

1.2.2 于采集24 小時(shí)內(nèi)水平梯度離心，吸取中間以淋巴細(xì)胞為主的云霧層。

1.2.3 采用TIANGEN 生產(chǎn)的微量樣品總RNA 提取試劑盒提取外周血中中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞中RNA，嚴(yán)格按照說明書的步驟進(jìn)行。RNA 提取后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度和純度，于-80℃冰箱保存。

1.2.4 每個(gè)樣本分別取RNA 5ug，采用TIANGEN 生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。再以第一鏈cDNA 2 為模板進(jìn)行PCR。

1.2.5 采用RT-PCR 法來評(píng)估檢測(cè)患兒外周血中TLR2、4mRNA的相對(duì)表達(dá)量，在這項(xiàng)研究中使用的引物見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重癥支原體肺炎患兒熱程明顯長(zhǎng)于普通支原體肺炎，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；重癥支原體肺炎患兒住院時(shí)間明顯長(zhǎng)于普通支原體肺炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：重癥支原體肺炎組患兒與普通支原體肺炎相比，C-反應(yīng)蛋白明顯增高，血沉明顯增快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 支原體肺炎組與健康體檢患兒組相比，外周血中TLR-2、TLR-4 mRNA 表達(dá)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重癥支原體肺炎組外周血中TLR-2、TLR-4 mRNA 表達(dá)量明顯高于普通支原體肺炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 TLR2、 TLR4mRNA 引物序列

3 討論

近年來，國(guó)內(nèi)外重癥及難治性肺炎支原體感染病例數(shù)逐漸增多，大環(huán)內(nèi)酯類治療效果不佳的支原體肺炎患者病例數(shù)逐漸增多[13]。部分重癥支原體肺炎治療效果不佳，引起胸腔積液、肺不張，甚至累計(jì)全身多臟器的并發(fā)癥。支原體肺炎的感染致病機(jī)制近幾年在國(guó)內(nèi)外研究中取得進(jìn)展[14]。支原體是區(qū)別于細(xì)菌及病毒，在自然界獨(dú)立存在的病原微生物，研究顯示通過免疫介導(dǎo)的肺損傷目前認(rèn)為主要是其致病機(jī)制[15]。TOLL 樣受體家族作為人體先天免疫的重要識(shí)別受體，是承接先天免疫及后天免疫的重要橋梁[16]。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示，肺炎支原體感染患兒外周血中TLR2、TLR4mRNA 的相對(duì)表達(dá)量較健康對(duì)照組患兒明顯增多，重癥支原體肺炎組患兒較普通組支原體肺炎患兒相對(duì)表達(dá)量增多，本研究再次驗(yàn)證了該觀點(diǎn)。為探尋重癥支原體肺炎的早期識(shí)別及治療的靶點(diǎn)提供新的思路。