杜佳，侯淵博

（1 中國科學院腫瘤與基礎醫(yī)學研究所，中國科學院大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州；2 浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州）

1 背景介紹

近 年 來，多 重 耐 藥（multidrug-resistant， MDR）和 全 耐 藥（pan-drug-resistant， PDR）肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌愈發(fā)增多，這些細菌往往攜帶碳青霉烯酶，此酶可以使絕大多數β 內酰胺類抗菌藥物失活，并且這些細菌還攜帶可以水平轉移的耐藥質粒，進一步加劇了耐藥傳播[1]。針對這些耐藥細菌，目前臨床尚缺乏有效的治療措施，迫使臨床醫(yī)生選擇已摒棄使用的多粘菌素和磷霉素進行治療，但是治療效果都不理想[2]。

體外實驗表明MDR 細菌通常對多粘菌素表現敏感，但是隨著臨床用量的增加，細菌對多粘菌素的耐藥率呈逐年遞增的趨勢。目前用藥指南明確指出磷霉素只適用于治療尿路感染，這樣做的目的是可以降低耐藥率的發(fā)生[3]。由于MDR 細菌對多粘菌素非常敏感，耐藥率極低，因此多粘菌素被認作為最后一道“防線藥物”[4]。本綜述主要針對目前多粘菌素耐藥機制及耐藥變遷做闡述。

2 多粘菌素介紹

多粘菌素是一種具有殺菌活性的陽離子肽類物質，最早于1947 年從土壤細菌Paenibacilluspolymyxa 中分離得到。目前用于臨床治療的主要是多粘菌素B 和多粘菌素E，二者在結構上只有一個氨基酸不同，但效果卻明顯不同[5,6]。相比多粘菌素B 更為直接激進的作用效果，多粘菌素E 反而會更溫柔遲緩一點，毒力也較弱，因此也更多的用于臨床治療[7,8]。

多粘菌素的作用位點是革蘭陰性菌的外膜，與脂多糖（LPS）脂質A 的磷酸基團親和。具體機制為，脂質A 帶負電荷，兩端被二價陽離子Ca2+ 和Mg2+ 包圍，多年菌素帶正電荷可以替換Ca2+ 和Mg2+ 破壞細菌外膜的穩(wěn)定性，滲透性改變、細菌內容物流失、細菌死亡[9]。

多粘菌素除了具有良好的殺菌作用外，還具有比較嚴重的副作用，如神經毒性和腎毒性。正是因為這些副作用，多粘菌素于1970 年被β 內酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物替代。最近幾年由于細菌對這些藥物耐藥率愈發(fā)增高，多粘菌素又重新用于臨床。值得注意的是，多粘菌素除了臨床上使用外，一些國家在養(yǎng)殖業(yè)上存在過度使用多粘菌素的現象[10,11]，這也是導致多粘菌素耐藥率增高的原因之一。

3 耐藥機制

3.1 天然耐藥

由于多粘菌素的作用位點是LPS，所以它的抗菌譜比較窄，其中包括大部分的革蘭陰性菌。革蘭陽性菌和一些厭氧菌外膜中沒有LPS，所以多粘菌素對這些細菌無作用。還有一些細菌如普羅威登絲菌屬、愛德華菌屬、布魯士菌屬、軍團菌屬及摩根摩根菌等均對多粘菌素天然耐藥，原因可能是由于這些細菌基因表達的陽離子產物添加到LPS，導致細菌外膜與多粘菌素親和力下降引起[12]。

3.2 基因表達水平改變引起耐藥

多數腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及嗜麥芽窄食單胞菌對多粘菌素敏感[13]。這些細菌出現對多粘菌素耐藥跟上述天然耐藥細菌一樣是LPS 結構發(fā)生改變導致。

目前在腸桿菌科細菌中，研究最多的主要為兩種分子結構——pEtN 和L-Are4N[10,14]。耐藥的產生是由于這兩種分子結構添加到LPS 上引起細菌外膜與多粘菌素親和力下降[15]。這兩種分子是由LPS 修飾酶基因pmrC、pmrE 和pmrHFIJKLM 表達控制，這些基因的表達則受控于PmrAB 和PhoPQ 雙組分系統[16-18]。除此之外，mgrB 和crrAB 也參與調控，MgrB 抑制PhoPQ 的表達，CrrAB 參與調控PmrAB 表達[19-22]。具體耐藥機制是由于參與調控這些信號通路中的某些基因發(fā)生突變引起，已知的有pmrA、pmrB、phoP 和phoQ 基因發(fā)生突變、mgrB 基因出現插入或缺失突變及crrB 基因發(fā)生突變。

在肺炎克雷伯菌中，其莢膜多糖可以阻止多粘菌素與外膜相結合[23,24]。另外一些外排泵（AcrAB 和KpnEF）的存在可以加速多粘菌素的外排，這些都可引起多粘菌素敏感性下降[25,26]。除了PmrA/PmrB 和PhoP/PhoQ TCS 外，銅綠假單胞菌中還存在ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 參與調控多粘菌素耐藥。在phoQ 突變菌株中如果ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 也發(fā)生基因突變，該菌株會出現高耐藥表型[27]。由此看來，ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs與PhoP/PhoQ TCS 可能存在交叉作用，colR/colS 和cprR/cprS 基因增強了PhoQ 的活性和LPS 結構發(fā)生添加L-Ara4N 改變的能力，進而導致高水平耐藥。這種效應可因colR/colS 和cprR/cprS 基因發(fā)生突變而受抑制。研究還表明ColR/ColS 和CprR/CprS TCSs 還可以調控其他未知基因表達水平介導L-Ara4N 修飾作用[27]。

3.3 異質性耐藥

臨床工作者在檢測大腸桿菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌多粘菌素藥敏的時候往往會遇到異質性耐藥現象。這種現象在用BMD 方法檢測時出現“跳空”或用紙片擴散法檢測是抑菌圈內出現菌落生長可以說明。當把這些菌落挑選出來繼續(xù)檢測藥敏發(fā)現異質性耐藥仍然存在。

圖1 CrrAB 介導多粘菌素耐藥及與PmrAB 和PhoPQ 之間關系[22]

在肺炎克雷伯菌研究中，Aurélie Jayol 等人發(fā)現，在對多粘菌素耐藥菌株用Etest 方法檢測多粘菌素的MIC 時，在抑菌圈當中出現散在的小菌落，作者將這些小菌落進行分純培養(yǎng)后，經PCR檢測發(fā)現此菌株存在PhoP(D191Y) 氨基酸替換，敲除回補試驗表明此突變介導菌株對多粘菌素耐藥[28]。Ana Silva 等人在研究肺炎克雷伯菌生物膜特性中，通過菌譜分析（Population analysis profile， PAP）方法發(fā)現在生物膜狀態(tài)下檢測到一種菌體較小的菌株，經分析后發(fā)現此菌株對多粘菌素的耐藥表型比較固定，可能是細菌處在生物膜狀態(tài)下，經群體感應系統的調節(jié)出現了異質性耐藥現象[29]。Myung-Jin CHOI 等人研究發(fā)現，與敏感株相比多粘菌素耐藥菌株HV 表型及CPS 表達量都發(fā)生下降，耐藥株的抗血清及生物膜形成能力也都發(fā)生降低。體外競爭試驗也發(fā)現耐藥株的競爭優(yōu)勢下降[30]。

Li 等人在鮑曼不動桿菌中發(fā)現，臨床分離的菌株中有90%的菌株對多粘菌素異質性耐藥。這些亞群菌株與增加多粘菌素耐藥和再生長有著密切關系[31]。但是，鮑曼不動桿菌對多粘菌素異質性耐藥的機制目前還不清楚。Alejandro Beceiro 等人研究發(fā)現，lpx 突變的菌株體外生長能力明顯下降，體外競爭和毒力也比敏感菌株有明顯下降[32]。

在陰溝腸桿菌科（Enterobacter cloacae complex， ECC）研究中發(fā)現，E.cloacae 菌株對多粘菌素耐藥具有一定的種群特異性，深入研究機制后發(fā)現，ECC 中多粘菌素異質性耐藥是由于PhoPQ雙組分調控系統控制arn 操縱子基因表達引起的。與E.coli，S.enterica 和K.pneumoniae 不 同 的 是，ECC 菌 株 中PmrAB 和PhoPQ 之間不存在交叉關系[33]。

3.4 質粒介導耐藥

Liu 等人[34]首次發(fā)現了質粒介導多粘菌素耐藥基因——mcr-1。該基因陽性標本主要來源于動物，人源性標本陽性率要遠低于動物源性標本，可能是跟多粘菌素藥物在畜牧業(yè)的使用量較大有關系。研究還發(fā)現，mcr-1 基因具有較強的傳播性，可以轉移到肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌中，且mcr-1 可以與不同的耐藥基因整合于同一個轉移性質粒上，因此這種質粒具有較強的危險性。

自mcr-1 基因首次發(fā)現后，世界范圍內（包括歐洲、南亞、非洲和美洲地區(qū)等）出現了大量關于mcr-1 的報道[35-41]，說明mcr-1成為全球性問題是不可避免的。目前mcr-1 基因主要存在于大腸桿菌中，在沙門菌和肺炎克雷伯菌中也有檢出，但報道較少。鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌中至今未有報道。Yu 等人首次報道了一例整合在耐碳青霉烯大腸桿菌染色體上的mcr-1 基因，這可能與mcr-1 基因在傳播過程中發(fā)生了衍變有關。雖然mcr-1 基因在2015 年首次報道，但是有研究報道顯示2012 的大腸桿菌中也有檢出mcr-1 基因，根據目前結果推測mcr-1 基因的出現有可能會更早。mcr-1 基因在人、食物、水、農場養(yǎng)殖動物甚至遷徙的鳥類源性標本中均有檢出[34，40，42]，在多重耐藥菌如產ESBL 和碳青霉烯酶的大腸桿菌中也有報道[43,44]。且這些陽性質粒分型種類較多，提示mcr-1 基因的兼容性非常好。2016 年7 月，比利時地區(qū)來源于豬和牛的大腸桿菌中檢出一種新的質粒介導多粘菌素耐藥基因mcr-2[45]。該基因在牛來源大腸桿菌中的檢出率要遠高于mcr-1 的檢出率。MCR-1 和MCR-2 具有80.65%的蛋白相似度，同屬于磷酸乙胺醇家族，可介導lipidA 添加磷酸乙胺醇基團引起細菌LPS 與多粘菌素親和力下降[34]。在Liu 等人[34]的研究中，攜有mcr-1 的質粒命名為pHNSHP45，是一個大小為64Kb 左右的IncI-like 質粒，預測有83 個開放閱讀框架（ORFs），G+C 含量為42.7%。該質粒最早在2013 年7 月份的一株來源于養(yǎng)豬場分離的大腸桿菌分離得到。藥敏結果顯示該大腸桿菌對大多數的抗菌藥物都耐藥，但是對碳青霉烯類藥物保持敏感[34]。攜帶mcr-2的質粒命名為pKP37-BE，是一個大小為35Kb 左右的IncX4 型質粒，G+C 含量為41.3%，不攜帶其他耐藥基因。目前為止，已有8種mcr 基因突變體被報道（mcr-1， mcr-2， mcr-3， mcr-4， mcr-5， mcr-6， mcr-7， mcr-8）[36-42]，且攜帶mcr 基因的質粒載體種類多變，此現象也加劇了mcr 基因的傳播，由此帶來的傳播危害值得密切關注。

3.5 交叉耐藥

根據目前研究結果發(fā)現，一些多粘菌素年耐藥的革蘭陰性菌并沒有出現雙組分調控系統中相應基因突變，也不存在異質性耐藥、質粒介導耐藥。對于這些菌株耐藥機制是如何產生的，交叉耐藥可能是最好的解釋。有研究表明，醫(yī)用消毒劑（如洗必泰）在臨床消毒過程中廣泛使用，可能引起了細菌多多件菌素的交叉耐藥[46]。洗必泰以種陽離子形式存在，它可以替換細菌外膜磷脂雙層中的二價陽離子（Ca2+ 和Mg2+）導致細菌外膜結構瓦解，細菌內容物外泄死亡。

綜上可以看出洗必泰的殺菌機制與多粘菌素相似，都是與細菌的外膜結合。Matthew E et al 等人[46]研究發(fā)現，通過體外誘導試驗使肺炎克雷伯菌對洗必泰耐藥，這些耐藥菌同時產生了對多粘菌素耐藥。肺炎克雷伯菌對洗必泰的耐藥機制與phoPQ 和smvR 基因突變有關，smvR 基因是Tet 抑制基因，與外排泵基因smvA 相鄰。smvR 基因發(fā)生突變后，smvA 基因的表達量升高。而體外誘導肺炎克雷伯菌對多粘菌素耐藥后，并不會產生對洗必泰耐藥。根據Matthew E et al 等人研究結果可以發(fā)現，肺炎克雷伯菌對多粘菌素耐藥可能與消毒劑的使用有交叉關系，這為臨床預防感染提供一定幫助。

4 結論與展望

近年來由于新藥的缺乏，臨床較多使用多粘菌素治療MDR 革蘭陰性菌引起的感染以及畜牧業(yè)中多粘菌素的濫用導致了多粘菌素耐藥率的升高。值得警惕的是，質粒介導到多粘菌素耐藥的出現加劇了耐藥的傳播。因此，多粘菌素耐藥機制的研究在學術上受到了較多關注。

正是由于新藥的缺乏，在治療MDR 革蘭陰性菌感染方面，多粘菌素可能還會處于主力地位。目前，一種新型復合制劑藥頭孢他啶/阿維巴坦用于臨床治療。這種復合制劑是一種β 內酰胺抗生素和有一種β 內酰胺酶抑制劑的組合，這種β 內酰胺酶抑制劑只能抑制A 類碳青霉烯酶，對B 類金屬β 內酰胺酶無效，因此這種復合制劑并不能廣泛使用。Mcr 抑制劑目前仍處于研究階段，真正運用于臨床還尚需較長時間。因此，有效的感染控制措施（如抗生素管制和耐藥監(jiān)測）是目前應對最近出現的多粘菌素耐藥問題的首要方案。