黃琪峰 鄭琳琳 張菁

摘要：目的? 利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測人類miR-222的靶基因，并分析其可能參與甲狀腺癌的生物學(xué)過程和信號通路。方法? 通過TCGA數(shù)據(jù)庫研究miR-222的表達(dá)與甲狀腺癌的關(guān)系，然后TCGA中表達(dá)下調(diào)的基因和網(wǎng)站預(yù)測的miR-222靶基因進(jìn)行取交集得到重疊基因，再進(jìn)行生物信息學(xué)分析確定與甲狀腺癌相關(guān)的關(guān)鍵miR-222靶基因和通路，最后通過GEPIA對靶基因進(jìn)行表達(dá)驗證以及miR-222和靶基因的相關(guān)性分析。結(jié)果? miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)，富集分析表明miR-222很有可能參與血管緊張素受體-配體結(jié)合的調(diào)節(jié)，其中一個可能的靶基因是AGTR1，其在甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)，與miR-222的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論? 上調(diào)的miR-222可能以AGTR1為靶標(biāo)，從而調(diào)節(jié)甲狀腺癌中血管緊張素受體-配體結(jié)合發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：甲狀腺癌;miR-222;AGTR1;生物信息學(xué)

中圖分類號：R736.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.026

文章編號：1006-1959（2020）01-0085-04

Prediction of Key Target Genes of miR-222 in Thyroid Cancer and Analysis of Its Signal Pathway

HUANG Qi-feng1，ZHENG Lin-lin2，ZHANG Jing1

（Department of Pharmacy1，Department of Ultrasound2，Run Run Shaw Hospital，Zhejiang University School of Medicine，

Hangzhou 310016，Zhejiang，China）

Abstract：Objective? To predict the target genes of human miR-222 using bioinformatics technology， and analyze the biological processes and signal pathways that miR-222 may participate in. Methods? TCGA database was used to study the relationship between miR-222 expression and thyroid cancer， then the genes with down-regulated expression in TCGA and miR-222 target genes predicted by the website were intersected to obtain overlapping genes， and bioinformatics analysis was performed to determine the correlation with thyroid cancer the key miR-222 target genes and pathways， and finally the target genes were verified by GEPIA and the correlation analysis between miR-222 and target genes. Results? miR-222 expression was significantly up-regulated in thyroid cancer. Enrichment analysis showed that miR-222 is likely to be involved in the regulation of angiotensin receptor-ligand binding. One of the possible target genes is AGTR1， which is expressed in thyroid cancer.Down-regulation was significantly negatively correlated with miR-222 expression.Conclusion? The up-regulated miR-222 is likely to target AGTR1， which may play a role in regulating angiotensin receptor-ligand binding in thyroid cancer.

Key words：Thyroid cancer;miR-222;AGTR1;Bioinformatics

甲狀腺癌（thyroid cancer）是最常見的內(nèi)分泌性惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展受多種調(diào)控因子共同作用，其具體機(jī)制目前尚不明確，因此確定其具體的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)敏感的生物標(biāo)志物和創(chuàng)新治療方法來提高甲狀腺癌的臨床診斷和治療水平是緊迫且具有挑戰(zhàn)性的課題。微小RNA（miRNA）是一類含量豐富的非編碼RNA分子，大小為15～21個核苷酸，它通過與目標(biāo)基因的3'非翻譯區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合從而使目標(biāo)基因沉默。miRNA已經(jīng)被證實對廣泛的生物過程具有調(diào)節(jié)作用，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[2，3]。miRNA使癌癥在臨床診斷和治療中取得了較大進(jìn)展[4，5]。研究表明[6]，miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)明顯高于正常組織，提示其可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，因此探索其在甲狀腺癌發(fā)病中的分子機(jī)制具有重要的意義。本研究利用生物信息學(xué)的方法來預(yù)測miR-222在甲狀腺癌中的目標(biāo)基因及其參與的信號通路，旨在闡明甲狀腺癌的潛在生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步深入研究其生物功能及臨床治療甲狀腺癌提供線索。

1資料與方法

1.1資料來源? 從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）下載510例甲狀腺癌和58例癌旁組織的mRNA-seq數(shù)據(jù)和miRNA-seq數(shù)據(jù)，并取Log2將其表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化。從miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫[7]下載人類miR-222可能的靶基因數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1 miR-222表達(dá)? 選取miR-222在甲狀腺癌及其癌旁組織的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用GraphPad Prism7繪制其在癌組織和正常組織的表達(dá)圖。

1.2.2 miRNA的差異表達(dá)? 利用計算機(jī)R軟件中edgeR包篩選出510例癌癥組織與58例癌旁組織相比表達(dá)下調(diào)的基因，篩選條件為：Log2|差異倍數(shù)（FC）|<-0.5489，F(xiàn)DR<0.05。為了更好更準(zhǔn)確的識別miR-222的目標(biāo)基因，對miRWalk網(wǎng)站預(yù)測的基因與表達(dá)下調(diào)的基因取交集，然后根據(jù)這些重疊基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析來探索miR-222在甲狀腺癌中潛在分子機(jī)制。

1.2.3基因富集分析? 利用DAVID[8]（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對重疊基因進(jìn)行功能注釋，包括分子功能、細(xì)胞組成與生物過程的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

1.2.4重疊基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)? 通過在線分析網(wǎng)站STRING[9]（https：//string-db.org/）得到差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將所得源文件導(dǎo)入Cytoscape[10]進(jìn)行可視化分析，然后使用MCODE插件查找蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中連接最密集的區(qū)域。

1.2.5 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析目標(biāo)基因表達(dá)? 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫[11]（http：//gepia.cancer-pku.cn/）驗證目標(biāo)基因在癌癥組織與癌旁組織的基因表達(dá)差異，并利用GraphPad Prism7繪制目標(biāo)基因的表達(dá)量與miR-222的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析? 標(biāo)準(zhǔn)化后的mRNA和miRNA表達(dá)呈正態(tài)分布，采用非配對t檢驗其在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，采用Pearson相關(guān)性分析目標(biāo)基因與miR-222的表達(dá)相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在篩選差異表達(dá)基因和對重疊基因富集分析時用Benjamini-Hochberg方法校正P值（FDR）。

2結(jié)果

2.1甲狀腺癌組織和癌旁組織中miR-222表達(dá)比較? 從TCGA下載得到的miR-222在甲狀腺癌中和癌旁組織的表達(dá)，miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2 miR-222的目標(biāo)基因? 通過TCGA中基因的差異表達(dá)分析和miRWalk靶基因預(yù)測平臺可以篩選出miR-136-5p可能的靶基因。其中TCGA中甲狀腺癌共有801個差異表達(dá)基因，miRNA-222在甲狀腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，選擇342個下調(diào)基因，miRWalk網(wǎng)站預(yù)測的目標(biāo)基因有16912個，兩者重疊得到279個miR-222可能的目標(biāo)基因。

2.3重疊基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 GO和KEGG 富集分析? GO分析表明重疊目標(biāo)基因的生物學(xué)過程主要富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、消化、化學(xué)性突觸傳遞、質(zhì)膜的組成成分、細(xì)胞連接、突觸、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜等生物學(xué)過程和功能中，KEGG富集分析顯示重疊目標(biāo)基因的信號通路主要為神經(jīng)活性配體-受體相互作用，見表1。

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和目標(biāo)基因分析? 根據(jù)重疊基因構(gòu)建得到一個包含279個節(jié)點(diǎn)、527條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，利用MCODE插件在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中查找連接最密集的區(qū)域得到12個可能的目標(biāo)基因，分別為SST、AGTR2、CHRM2、PENK、NPY2R、NPY5R、AGTR1、HTR1E、CCKBR、CCKAR、MLN、GCG，見圖2。

2.4目標(biāo)基因的驗證

2.4.1目標(biāo)基因在甲狀腺癌中的表達(dá)? 共查找到12個目標(biāo)基因在甲狀腺癌中的表達(dá)，由于miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)量比癌旁組織高，其目標(biāo)基因應(yīng)在甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)，最終篩選出AGTR1，見圖3。

2.4.2目標(biāo)基因AGTR1與miR-222的Pearson相關(guān)分析? Pearson相關(guān)分析表明，目標(biāo)基因AGTR1的表達(dá)與miR-222的表達(dá)在甲狀腺癌患者中呈負(fù)相關(guān)（r=-0.435，P=1.1293E-27），見圖4。

3討論

據(jù)不完全統(tǒng)計，約30%以上的人類蛋白編碼基因受miRNA的調(diào)控[12]。越來越多的文獻(xiàn)報道，miRNA可以通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)來參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等細(xì)胞活動，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移[2，3]以及治療等方面發(fā)揮重要作用。但目前已明確的miRNA的靶基因數(shù)量有限，且生物學(xué)功能尚未完全明確[13]。因此，通過生物信息學(xué)預(yù)測miRNA 的靶基因，對其靶基因進(jìn)行生物功能富集分析和信號通路富集分析，有助于確定miRNA的研究方向，具有重要指導(dǎo)意義。

研究報道，miR-222在甲狀腺惡性腫瘤診斷上具有較高的敏感性[14]，且miR-222的過度表達(dá)與甲狀腺癌復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等一些高風(fēng)險特征相關(guān)，miR-222可以作為甲狀腺癌潛在的靶點(diǎn)[15-17]。

本研究中，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中miRNA測序發(fā)現(xiàn)miR-222在甲狀腺癌中的表達(dá)高于癌旁組織。GO富集分析顯示，miR-222的目標(biāo)基因的生物學(xué)過程主要富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、消化、化學(xué)性突觸傳遞、質(zhì)膜的組成成分、細(xì)胞連接、突觸、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜等生物學(xué)過程和功能中。KEGG 信號通路分析結(jié)果顯示，miR-222靶基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用等信號通路上?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，miR-222很有可能參與受體-配體結(jié)合的調(diào)節(jié)。同時，通過目標(biāo)基因在甲狀腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異篩選得到目標(biāo)基因AGTR1，發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌中與miR-222的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.435，P=1.1293E-27）。AGTR1是血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體，是調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的受體。研究表明，AGTR1與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，AGTR1參與多種類型的惡性腫瘤，比如乳腺癌[18]、皮膚癌[19]、前列腺癌[20]、婦科腫瘤[21]等。因此，miR-222可能是以AGTR1為靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，從而參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。但這只是預(yù)測，未來需要更多的研究去證實。

綜上所述，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-222在甲狀腺癌中表達(dá)上升，預(yù)測其靶基因可能是AGTR1，并可能通過血管緊張素配體-受體結(jié)合信號通路中調(diào)節(jié)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。

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收稿日期：2019-10-01;修回日期：2019-10-21

編輯/成森