張文沫，豐宏林

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150001)

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種破壞性神經(jīng)退行性疾病，累積上、下運(yùn)動神經(jīng)元，其特征為運(yùn)動神經(jīng)元的喪失，可導(dǎo)致進(jìn)行性肌肉無力和萎縮、呼吸衰竭和死亡，疾病進(jìn)展通常較快，平均生存期為癥狀出現(xiàn)后2～3年，發(fā)病率達(dá)1/100 000～2/100 000[1]，目前其發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，存在自身免疫、氧化應(yīng)激、興奮毒性、神經(jīng)炎癥等多種假說，許多環(huán)境因素(如吸煙、重金屬或殺蟲劑、輻射和某些類型的體育活動)也被認(rèn)為可能與ALS的神經(jīng)病理學(xué)改變相關(guān)[2]。ALS主要分為散發(fā)性ALS(sporadic amyotrophic lateral sclerosis，sALS)和家族性ALS(familial amyotrophic lateral sclerosis，fALS)兩種類型。10%～15%的fALS與人類染色體30多個區(qū)域的大量基因突變有關(guān)，其余85%～90%的fALS病因不明[3]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)[4]、TARDBP[5]、FUS[6]、OPTN[7]、VCP[8]、UBQLN2[9]、C9orf72[10]和TBK1[11]等20多種基因與ALS相關(guān)，且遺傳和非遺傳因素均在ALS發(fā)病中起作用。

為了尋找ALS的治療藥物以及延緩疾病進(jìn)展，學(xué)者開展了許多針對ALS的動物模型實驗和臨床前人體試驗，但迄今為止還沒有真正的突破。美國食品藥品管理局批準(zhǔn)利魯唑(阻止過量神經(jīng)傳遞的神經(jīng)保護(hù)藥物)和依達(dá)拉奉(抗氧化劑)用于ALS的治療[12]。利魯唑是首個獲批用于ALS治療的藥物，與安慰劑相比，利魯唑治療ALS患者的預(yù)后顯著改善[13]。依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，被批準(zhǔn)用于腦栓塞的治療。依達(dá)拉奉的第三階段臨床試驗(MCI186-19研究)證實，其能夠抑制ALS患者運(yùn)動無力的惡化，并能顯著改善ALS功能評分量表評分。有數(shù)據(jù)顯示，ALS患者早期開始依達(dá)拉奉治療的效果更好[13]。

以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療是目前神經(jīng)退行性疾病治療的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞治療通過移植新的神經(jīng)元替換退化或死亡的神經(jīng)元，使干細(xì)胞或祖細(xì)胞以某種方式在體內(nèi)分化為所需的細(xì)胞類型?，F(xiàn)就干細(xì)胞移植治療ALS的研究進(jìn)展予以綜述。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的多能干細(xì)胞，可來源于新生兒和成人的多種組織，如臍帶血[14]、臍帶組織[15]、骨髓[16]、脂肪組織[17]和口腔組織[18]。MSCs移植作為多種組織和器官疾病的治療方案，在動物模型實驗和人體試驗中得到了證實，包括缺血性腦損傷[19]和神經(jīng)退行性疾病[20]。目前，鞘內(nèi)注射和靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的Ⅰ期試驗尚無相關(guān)不良反應(yīng)的報道[21]；此外，注射脂肪來源MSCs的相關(guān)試驗也較安全[22]。已有研究表明，將人或嚙齒動物來源MSCs移植至標(biāo)準(zhǔn)SOD1突變體SOD1G93A小鼠，能明顯改善運(yùn)動功能和延長壽命，與0.9%氯化鈉注射液組相比，MSCs組小鼠四肢的運(yùn)動活性和運(yùn)動功能更好，體重下降速度減慢，平均壽命延長[23]。對ALS患者進(jìn)行早期觀察和0期自體MSCs移植實驗的研究表明，椎管內(nèi)注射自體MSCs的耐受性良好，且未出現(xiàn)不可逆的手術(shù)相關(guān)不良反應(yīng)[24-26]，隨后的Ⅰ期試驗和長期隨訪均證明了其安全性[27-28]。

近年來，越來越多的研究對大量受試者進(jìn)行了更詳細(xì)的試驗。有文獻(xiàn)報道，與標(biāo)準(zhǔn)對癥治療(如神經(jīng)代謝藥物)對照者相比，接受MSCs移植ALS患者的疾病進(jìn)展緩慢，尤其是假性延髓麻痹和呼吸系統(tǒng)疾病，可見MSCs移植能夠提高ALS患者的生活質(zhì)量[29]。有學(xué)者將37例BMSCs移植ALS患者分為“應(yīng)答者”和“無應(yīng)答者”兩組，結(jié)果顯示前者ALS功能評分量表評分的降幅明顯較小[30]。另有研究使用培養(yǎng)中分化的BMSCs增強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，將這些細(xì)胞肌內(nèi)聯(lián)合鞘內(nèi)注射給14例患者，與移植前3個月的磨合期相比，BMSCs移植后6個月的隨訪期內(nèi)ALS功能評分量表評分和用力肺活量下降程度均減少[31]。由此可見，BMSCs移植可改善ALS患者的臨床癥狀。

研究表明，MSCs在培養(yǎng)中的神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化是可以實現(xiàn)的[32]。將BMSCs或表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)素受體細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中時，其可表達(dá)神經(jīng)元或膠質(zhì)標(biāo)志物[33]。有報告顯示，移植的MSCs可表達(dá)多個運(yùn)動神經(jīng)元標(biāo)志物，表明MSCs可分化為運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞[34]。MSCs移植治療可能通過延長受損運(yùn)動神經(jīng)元的生存時間以及保存現(xiàn)有運(yùn)動回路來發(fā)揮作用，可以通過以下幾種方式實現(xiàn)。

1.1MSCs分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的旁分泌效應(yīng) 表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的人MSCs均能促進(jìn)運(yùn)動神經(jīng)元的存活[35]。人臍帶MSCs能夠分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子-1、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)6種不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這些分泌因子單獨(dú)或聯(lián)合均可以旁分泌的方式促進(jìn)病變運(yùn)動神經(jīng)元的存活[36]。

1.2MSCs對外周血T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用 幾乎所有的神經(jīng)退行性疾病均伴有一定程度的炎癥反應(yīng)，ALS的發(fā)生和發(fā)展與循環(huán)免疫細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中免疫細(xì)胞誘發(fā)的神經(jīng)炎癥有關(guān)[37]。炎癥抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)水平與ALS疾病進(jìn)展和嚴(yán)重程度相關(guān)是循環(huán)免疫細(xì)胞影響ALS發(fā)病及進(jìn)展的重要發(fā)現(xiàn)之一[38]。在病情進(jìn)展迅速的ALS患者中，Treg細(xì)胞數(shù)量以及Treg細(xì)胞表達(dá)的重要標(biāo)志物叉頭樣螺旋轉(zhuǎn)錄因子3的水平均降低，且Treg細(xì)胞數(shù)量與疾病進(jìn)展速度呈負(fù)相關(guān)[39]。MSCs與ALS患者外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)時，γ干擾素、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-10等抗炎細(xì)胞因子水平升高，Treg細(xì)胞誘導(dǎo)增強(qiáng)[40]；此外，MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力明顯由固有免疫介導(dǎo)的Toll樣受體介導(dǎo)[41]。因此，隨著外周免疫細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，MSCs移植誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞潛能顯得尤為重要。

1.3MSCs對膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的潛在調(diào)節(jié)作用 除外周免疫細(xì)胞外，MSCs還可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)。非神經(jīng)元細(xì)胞自主性因素是ALS的重要病理學(xué)特點(diǎn)，而中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對運(yùn)動神經(jīng)元的死亡起著至關(guān)重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞相當(dāng)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周免疫細(xì)胞，幾乎與所有的神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[42]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元保護(hù)和損傷中起重要作用。MSCs對小膠質(zhì)細(xì)胞活化具有調(diào)節(jié)作用。在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系的實驗?zāi)Ｐ椭?，MSCs通過可溶性因子(如轉(zhuǎn)化生長因子-β)減少脂多糖刺激下的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和增殖[43]，且在動物ALS模型中移植人MSCs可以調(diào)節(jié)疾病環(huán)境中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[44]，但其影響機(jī)制尚待深入研究。

在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的移植治療中，移植細(xì)胞的存活和復(fù)制至關(guān)重要，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境的惡化不利于移植MSCs的存活。此外，人類受體中的移植MSCs的進(jìn)一步追蹤和長期復(fù)制潛能(包括腫瘤發(fā)生潛能)的監(jiān)測尚未實施。非侵入性技術(shù)的發(fā)展，如基于近紅外線的發(fā)光探針標(biāo)記移植細(xì)胞成像[45]，可能更好地實現(xiàn)對MSCs的追蹤。未來MSCs的相關(guān)發(fā)展對于ALS甚至任何基于干細(xì)胞的治療平臺均至關(guān)重要。

2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)也是一種自體細(xì)胞來源的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞，可分化成多種細(xì)胞類型，如特異性運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞，在ALS等退行性疾病的治療方面具有巨大的應(yīng)用前景[46]。Sareen等[47]利用人類成纖維細(xì)胞系進(jìn)行的臨床前研究證明，iPSCs衍生細(xì)胞可以移植并整合到大鼠脊髓中。另有文獻(xiàn)報道，iPSCs人類白細(xì)胞抗原特征的iPSCs數(shù)據(jù)庫可能代表了一種很有前景的技術(shù)，可獲得高質(zhì)量細(xì)胞產(chǎn)物，并可降低移植物排斥反應(yīng)的風(fēng)險，且人iPSCs在ALS嚙齒動物衍生神經(jīng)干/祖細(xì)胞移植的應(yīng)用中顯示出一定程度的療效[48]。此外，將iPSCs分化為類似中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，即腦器官，不僅為人類大腦發(fā)育和疾病再現(xiàn)的研究提供了機(jī)會，還為細(xì)胞移植提供了新的來源?，F(xiàn)已成功嘗試將人腦器官移植至嚙齒動物腦內(nèi)，植入后的微型大腦整合到宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，表現(xiàn)出進(jìn)行性神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)分化，在宿主腦的多個區(qū)域形成血管網(wǎng)絡(luò)，且軸突連接不斷增長[49]。目前，首例帕金森病患者移植iPSCs衍生多巴胺能神經(jīng)元的試驗已完成，且越來越多的iPSCs衍生細(xì)胞療法正在進(jìn)行臨床試驗測試[50]。首次基于iPSCs移植的ALS臨床試驗已于2019年開始[51]。

iPSCs為神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞病因?qū)W提供了新的線索。iPSCs不僅具有自我更新、產(chǎn)量高、可擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，還具有產(chǎn)生多種不同神經(jīng)元亞型的潛力[52]。iPSCs在疾病神經(jīng)元衍生中具有明顯作用，特別是可保留與年齡相關(guān)的疾病特征，這是神經(jīng)退行性疾病模型建立的關(guān)鍵，但iPSCs仍有其局限性，其潛在機(jī)制仍有待證實。

3 神經(jīng)干細(xì)胞

MSCs和免疫細(xì)胞可能通過旁路效應(yīng)對ALS產(chǎn)生積極影響，但不能取代受損中樞神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)指神經(jīng)系統(tǒng)中具有分化潛能的神經(jīng)細(xì)胞(如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)，可為腦組織提供大量的細(xì)胞群。神經(jīng)干細(xì)胞可能提供神經(jīng)營養(yǎng)支持和取代膠質(zhì)細(xì)胞或中間神經(jīng)元，并可能通過分泌多種分子和生長因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。歐洲和美國已經(jīng)開展了利用人胚胎組織來源的神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)物中擴(kuò)增的ALS相關(guān)試驗[53-54]。有研究使用從人類8周胚胎脊髓中獲得的特殊的人脊髓源性干細(xì)胞系(human spinal cord-derived stem cells，HSSCs)，將該細(xì)胞系置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并使用維持細(xì)胞增殖和避免細(xì)胞分化的成纖維細(xì)胞生長因子-2進(jìn)行體外擴(kuò)增[55]。臨床前研究表明，HSSCs主要產(chǎn)生中間神經(jīng)元，少數(shù)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞[56]。此外，HSSCs能夠分泌生長因子(包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和GDNF)，植入后，這些細(xì)胞可以表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，可恢復(fù)受損運(yùn)動神經(jīng)元周圍的功能性興奮性氨基酸再攝取[57]。對ALS大鼠模型中HSSCs移植的研究顯示，與接受死細(xì)胞移植對照組相比，HSSCs移植組的ALS發(fā)病時間延遲，存活時間延長，腹角運(yùn)動神經(jīng)元增加，對運(yùn)動癥狀的積極影響短暫，但通過多次脊髓NSCs注射可以有效改善ALS動物模型的存活率[58]。

將胎兒皮質(zhì)來源的NSCs移植至ALS模型SOD1G93A大鼠脊髓后，NSCs能夠分化為神經(jīng)保護(hù)性星形膠質(zhì)細(xì)胞；若NSCs經(jīng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生GDNF，對ALS模型SOD1G93A大鼠的運(yùn)動神經(jīng)元產(chǎn)生有益影響，不僅可延緩ALS模型SOD1G93A大鼠的發(fā)病、延長其存活時間、改善上運(yùn)動神經(jīng)元的健康狀況，甚至可提高ALS模型SOD1G93A大鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)元的存活率[59]。ALS患者的萎縮脊髓可以耐受至少3 mL 細(xì)胞懸液以及最多20次不同脊髓節(jié)段的注射；且NSCs移植后隨訪2年，未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長[60]?？梢?，NSCs移植未加速ALS的疾病進(jìn)展，且ALS患者的NSCs移植相對安全可行。

目前基于臨床前試驗的NSCs研究極有限，小范圍治療試驗的療效評估很難，尤其是無隨機(jī)安慰劑或觀察對照組的試驗。ALS的臨床進(jìn)展高度可變，目前導(dǎo)致這種變異的生物因素仍未知。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)對個體間疾病病程差異的因果關(guān)系。現(xiàn)有NSCs移植治療ALS的相關(guān)實驗證據(jù)的療效是否能夠立即進(jìn)行臨床治療試驗仍有待商榷，在進(jìn)一步的臨床試驗前，是否有必要提高NSCs移植的療效亦有待研究。

4 胚胎干細(xì)胞

人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)是一種源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)獲得的原始多能干細(xì)胞[61]。Wyatt等[62]將hESCs衍生的人運(yùn)動神經(jīng)元祖細(xì)胞移植到ALS動物模型發(fā)現(xiàn)，移植后的人運(yùn)動神經(jīng)元祖細(xì)胞可使大量的內(nèi)源性神經(jīng)元存活，并產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用。Izrael等[63]利用hESCs作為大量星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的來源，進(jìn)一步將星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞擴(kuò)增并分化為可表達(dá)90%以上膠質(zhì)纖維酸性蛋白的人類胚胎干細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞(human embryonic stem-astrocytes，hES-AS)，且移植后hESCs來源星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能特性已得到體外實驗的證明。Izrael等[63]進(jìn)一步對ALS動物模型(高拷貝數(shù)hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠)的研究發(fā)現(xiàn)，hES-AS鞘內(nèi)注射可明顯延緩hSOD1G93A小鼠和大鼠ALS的發(fā)病，并有助于維持運(yùn)動功能和延緩死亡；與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相似，hESCs可通過多種機(jī)制保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元，如清除谷氨酸、分泌多種神經(jīng)保護(hù)因子、中和活性氧類、促進(jìn)神經(jīng)生長；與空白載體溶液對照組相比，hESCs治療組大鼠運(yùn)動能力維持正常時間延長1個月以上；hESCs治療組大鼠的中位生存期為216 d，而對照組大鼠的中位生存期為182 d，表明鞘內(nèi)注射可延緩ALS發(fā)病和疾病進(jìn)展，進(jìn)而延長生存期。對免疫功能低下動物模型進(jìn)行為期9個月的安全性研究顯示，鞘內(nèi)移植hES-AS是安全的[63]。上述研究均證實了鞘內(nèi)注射hESCs治療ALS的可行性、安全性和潛在療效，但治療ALS的臨床試驗仍然很少，hESCs相關(guān)研究所涉及的倫理問題還有待解決，且安全性也有待進(jìn)一步探究；此外，hESCs的來源有限，且體外分化的條件極高，這些均限制了hESCs的應(yīng)用和發(fā)展。

5 小 結(jié)

干細(xì)胞的臨床前研究為人類試驗奠定了基礎(chǔ)，將干細(xì)胞分化為具有治療潛力的細(xì)胞，揭示了通過改善疾病微環(huán)境毒性減緩神經(jīng)退行性變的可能機(jī)制。目前，干細(xì)胞移植仍處于發(fā)展階段，早期臨床試驗已證實了其安全性，干細(xì)胞的再生能力較強(qiáng)，但現(xiàn)有技術(shù)尚無法將其充分利用并用于治療神經(jīng)退行性疾病。迄今為止，干細(xì)胞移植研究成果是否足以支持進(jìn)一步的臨床治療試驗仍有待深入研究，在已經(jīng)證明安全的干細(xì)胞源中，確定最有效的干細(xì)胞來源、劑量、給藥部位及方法，對進(jìn)一步提高干細(xì)胞移植治療的功效具有重要意義。干細(xì)胞移植在治療ALS和其他神經(jīng)退行性疾病方面具有巨大的應(yīng)用潛力，但以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療仍需要大量研究。