張雪，薛美玲，段秀慶

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，哈爾濱 150001)

導(dǎo)管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)又稱為導(dǎo)管內(nèi)癌，病變從末梢導(dǎo)管小葉開始，經(jīng)過細(xì)胞異常生長的不同階段，最終發(fā)展為DCIS。構(gòu)成DCIS的細(xì)胞具有惡性細(xì)胞的特征，但被局限在正常的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)內(nèi)，并未侵襲肌上皮細(xì)胞層和基膜。隨著浸潤性成分的出現(xiàn)，DCIS演變?yōu)榻櫺詫?dǎo)管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)，因此DCIS被認(rèn)為是IDC的癌前病變[1]。近年的研究也檢測到同一患者的DCIS成分與浸潤性成分的分子相似性[2]。其中，最能證明DCIS 到 IDC是一個(gè)連續(xù)發(fā)展過程的證據(jù)是其影響著同一解剖部位。在對 DCIS 的縱向研究中，活組織檢查發(fā)現(xiàn)，20%～25%的DCIS在同一乳房的同一象限內(nèi)演變成了IDC[3]。雖然DCIS可治愈，但因其是潛在致命的侵襲性乳腺癌的非專一性前體[4]，故其危害性不可忽視。自20世紀(jì)80年代乳房X線照射技術(shù)問世以來，DCIS的診斷率逐步提高。在美國新診斷的乳腺癌中，DCIS約占20%[5]。DCIS向IDC發(fā)展的機(jī)制尚待闡明。到目前為止，仍不能準(zhǔn)確區(qū)分哪些乳腺癌會保持持續(xù)惰性而進(jìn)展為IDC。因此，不管是否需要進(jìn)行輔助放化療或內(nèi)分泌治療，所有被診斷為DCIS的患者均被不加選擇地進(jìn)行手術(shù)切除治療[5]。這對于找出高侵襲性進(jìn)展DCIS的發(fā)生機(jī)制，并行針對性治療提出了挑戰(zhàn)。現(xiàn)就腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)、表觀遺傳學(xué)及基因變異在DCIS浸潤過程中發(fā)揮的作用予以綜述。

1 腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的作用

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移以及腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境，包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，并與腫瘤細(xì)胞自身(核和胞質(zhì))的內(nèi)在環(huán)境有關(guān)。研究表明，構(gòu)成微環(huán)境的細(xì)胞(肌上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)以及分子可以調(diào)節(jié)乳腺癌的組織特異性以及乳腺癌細(xì)胞的生長、存活、極性以及侵襲行為[6]。因此，腫瘤微環(huán)境對于正常乳腺的發(fā)育和乳腺腫瘤的發(fā)生非常重要[7]。

1.1肌上皮細(xì)胞 在正常乳腺中，肌上皮細(xì)胞與基膜接觸，包圍腔上皮細(xì)胞，后者依次排列在導(dǎo)管和腺泡中。肌上皮細(xì)胞被認(rèn)為是正常乳腺發(fā)育和功能作用的調(diào)節(jié)劑，在泌乳過程中通過其收縮功能使乳汁從導(dǎo)管內(nèi)排出，且對腔上皮細(xì)胞的極性、增殖和分化也有重要作用。肌上皮細(xì)胞通過分泌蛋白酶抑制劑以及下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的水平影響腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和血管生成。組織學(xué)上，肌上皮細(xì)胞的丟失是區(qū)分DCIS和IDC的一個(gè)關(guān)鍵因素，人們對肌上皮細(xì)胞丟失的機(jī)制以及是否調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲進(jìn)行了廣泛研究?？蛊交】贵w、肌球蛋白重鏈、s100、p63、CD10以細(xì)胞角蛋白14/17等標(biāo)志物可識別肌上皮細(xì)胞。DCIS異種移植模型的發(fā)展為研究DCIS的進(jìn)展機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[8]。理想的模型是將人乳腺癌細(xì)胞注入乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)后引發(fā)導(dǎo)管內(nèi)病變形成，并侵入周圍組織[8]。Russell等[9]發(fā)現(xiàn)，肌上皮細(xì)胞在入侵前會丟失其自身的某些標(biāo)志物，如p63、鈣結(jié)合蛋白和平滑肌肌動蛋白，而這些標(biāo)志物的丟失在人類DCIS樣本中也得到證實(shí)，表明肌上皮細(xì)胞的分化在侵襲之前已被破壞，這些標(biāo)志物的丟失可能是DCIS進(jìn)展的一個(gè)標(biāo)志。對人類活檢樣本的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在DCIS的肌上皮細(xì)胞中，肌球蛋白重鏈和CD10的低表達(dá)與并發(fā)間質(zhì)侵犯的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[10]。因此，將人乳腺癌細(xì)胞-10與DCIS異種移植模型中具有低侵襲性表型的衍生物或其他細(xì)胞系進(jìn)行比較，可能有助于識別腫瘤細(xì)胞釋放的旁分泌因子，旁分泌因子減少了肌上皮細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)，識別這些因子將幫助研究者發(fā)現(xiàn)DCIS入侵的其他潛在標(biāo)志物。

1.2癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞 正常成纖維細(xì)胞通過產(chǎn)生和重構(gòu)ECM維持細(xì)胞外環(huán)境。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的過程中發(fā)揮了重要作用。CAFs具有異質(zhì)性，其中一部分被鑒定為表達(dá)α平滑肌肌動蛋白的肌成纖維細(xì)胞，其他被鑒定為表達(dá)成纖維細(xì)胞的激活蛋白、肌間線蛋白、S100A4蛋白等[11]。Orimo等[12]研究表明，CAFs可通過分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/CXC趨化因子配體12促進(jìn)腫瘤生長和腫瘤血管生成，CXC趨化因子配體12通過CXC趨化因子受體4以旁分泌的方式增加腫瘤細(xì)胞的增殖。肝細(xì)胞生長因子是另一種CAFs衍生因子，可通過c-Met受體酪氨酸激酶發(fā)揮作用，被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要因子[13]。正常乳腺成纖維細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌肝細(xì)胞生長因子，并提高肝細(xì)胞生長因子的促腫瘤活性[14]。CAFs的起源已被廣泛研究，并提出了多種假設(shè)。一種是來源于天然間質(zhì)成纖維細(xì)胞，其表型已被鄰近腫瘤上皮細(xì)胞持續(xù)異常的信號所改變；也可由骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化，這些間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤衍生因子的刺激下被募集到腫瘤部位。從先前接受過同種異體骨髓移植的患者的腫瘤中鑒定出骨髓來源的細(xì)胞支持了這一假設(shè)[15]。但另一項(xiàng)研究表明，某些異種移植物通過激活和募集骨髓來源的細(xì)胞誘導(dǎo)弱致瘤細(xì)胞系的生長和轉(zhuǎn)移[16]，特別是表達(dá)顆粒蛋白的骨髓源性細(xì)胞，其既能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，也能促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長。這些數(shù)據(jù)以及來自其他實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)[17]支持了腫瘤源性信號刺激骨髓產(chǎn)生和釋放骨髓源性細(xì)胞，并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的這一假設(shè)。因此，靶向骨髓來源的細(xì)胞可能會影響局部和轉(zhuǎn)移性疾病的治療。

1.3白細(xì)胞 浸潤性白細(xì)胞在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其介導(dǎo)免疫和腫瘤細(xì)胞串?dāng)_的機(jī)制卻鮮為人知。DCIS中存在大量浸潤性白細(xì)胞，伴有局灶性肌上皮細(xì)胞層破壞[18]，表明白細(xì)胞可能在侵襲性進(jìn)展中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過激活表皮生長因子受體，分泌蛋白酶以及激活腫瘤細(xì)胞間的旁分泌信號，促進(jìn)血管生成、ECM降解以及腫瘤侵襲[19]。集落刺激因子-1缺陷小鼠丟失巨噬細(xì)胞對腫瘤的發(fā)生無影響，但大大減緩了惡性進(jìn)程[20]。用小鼠集落刺激因子-1反義寡核苷酸或集落刺激因子-1小干擾RNA處理免疫缺陷小鼠中源自人乳腺癌細(xì)胞-7的異種移植物發(fā)現(xiàn)，其通過減少巨噬細(xì)胞浸潤、MMP和血管內(nèi)皮生長因子-A的產(chǎn)生以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制乳腺腫瘤的生長[21]?？梢?，巨噬細(xì)胞在乳腺癌的進(jìn)展過程中有重要作用，并為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與不良臨床預(yù)后的關(guān)聯(lián)提供了合理解釋。除巨噬細(xì)胞外，其他免疫細(xì)胞也參與了乳腺癌的發(fā)展。在乳腺癌的小鼠模型中，使用白細(xì)胞介素-2免疫毒素融合蛋白后，CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加，且T細(xì)胞的系統(tǒng)性耗竭抑制了腫瘤生長，并維持強(qiáng)而持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)[22]。由于這些細(xì)胞是細(xì)胞介導(dǎo)免疫所必需，表明可能存在針對乳腺腫瘤的主動免疫反應(yīng)，其強(qiáng)度可能會影響遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

1.4腫瘤進(jìn)展中的基質(zhì)重構(gòu) 乳腺癌的ECM存在明顯異常，其可能促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展。MMP主要由成纖維細(xì)胞合成，通常參與組織重構(gòu)和切口愈合。除降解ECM外，MMP還可激活趨化因子、細(xì)胞因子、黏附分子以及生長因子，這些因子通過增加腫瘤細(xì)胞增殖或促進(jìn)血管生成促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[23]。乳腺腫瘤的異常生理特征(如異常膠原交聯(lián)導(dǎo)致ECM變硬)也會導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。這種硬化產(chǎn)生的力量導(dǎo)致整合素和生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，從而促進(jìn)入侵。賴氨酰氧化酶是一種常見于乳腺腫瘤的胺氧化酶，在乳腺癌的MMTV-Neu模型中，其促進(jìn)膠原蛋白交聯(lián)，增強(qiáng)ECM硬化，其抑制作用延緩了腫瘤進(jìn)展，減輕了腫瘤負(fù)擔(dān)[24]。多項(xiàng)研究檢測了ECM對DCIS侵襲性的影響。Wallace等[25]認(rèn)為，產(chǎn)后復(fù)舊是腫瘤進(jìn)展的驅(qū)動力。產(chǎn)后復(fù)舊是斷奶后哺乳期乳腺恢復(fù)到懷孕前狀態(tài)的過程。復(fù)舊的乳腺和乳腺腫瘤微環(huán)境具有共同的特征，即促進(jìn)腫瘤膠原蛋白表達(dá)、MMP上調(diào)、巨噬細(xì)胞浸潤以及血液和淋巴管重構(gòu)。與未產(chǎn)患者和產(chǎn)后窗外診斷的患者相比，產(chǎn)后復(fù)舊患者更易患侵襲性疾病，并具有更高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。信號蛋白-7a、環(huán)加氧酶-2和膠原蛋白均在復(fù)舊的乳腺中表達(dá)[25]，其共同作用使乳腺癌的無轉(zhuǎn)移生存率降低。另有研究表明，基質(zhì)細(xì)胞中溶血磷脂氧化酶的高表達(dá)與ECM修飾酶家族的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[26]。

2 表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)改變，即腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的可遺傳改變，不涉及DNA序列的改變，也可以解釋目前在DNA序列水平上DCIS與IDC的差異。從正常乳腺上皮到DCIS，DNA甲基化通常會增加，但大部分研究發(fā)現(xiàn)，DCIS與IDC中啟動子的超甲基化水平相似[27-29]。這表明，DNA甲基化的改變是乳腺癌發(fā)生的早期事件。組蛋白修飾與DNA甲基化共同作用是基因調(diào)控的關(guān)鍵，賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine specific demethylase，LSD)1是一種組蛋白甲基化擦除劑，作用于組蛋白H3K4和H3K9[30]。LSD1在乳腺腫瘤中高表達(dá)，在低、中、高級別DCIS與浸潤性乳腺癌中，LSD1的表達(dá)水平隨級別的增高而升高，再次表明乳腺癌進(jìn)展中存在早期表觀遺傳事件[31]。DCIS和IDC均有其特異的基因甲基化。Melnikov等[32]采用微陣列甲基化分析方法發(fā)現(xiàn)，突變型p73、蛋白激酶C delta結(jié)合蛋白和mut S同種組織蛋白2基因的甲基化只與DCIS有關(guān)，與IDC無關(guān)；血小板反應(yīng)蛋白l和脂肪酸結(jié)合蛋白3等基因的甲基化只與IDC有關(guān),而與DCIS無關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MIMAS也在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可以調(diào)控包括組蛋白去乙?；浮NA甲基轉(zhuǎn)移酶和多梳蛋白在內(nèi)的表觀遺傳修飾物[33]。

3 基因變異

IDC是最常見的乳腺癌類型，占乳腺癌病例的80%，而45%～78%的IDC與DCIS有關(guān)[34]。已有證據(jù)表明，DCIS是IDC的非專一性前體[1]，但用于區(qū)分DCIS和IDC的強(qiáng)大轉(zhuǎn)錄組或基因組特征仍在研究中。在研究過程中出現(xiàn)了兩種理論，在DCIS向侵襲性疾病轉(zhuǎn)變過程中選擇了具有特定遺傳變化的亞克隆，這導(dǎo)致DCIS與侵襲性樣本之間特異性擴(kuò)增和突變患病率的差異[35]。與此同時(shí)，有學(xué)者提出了一種多克隆進(jìn)化理論，該理論假設(shè)DCIS中的多個(gè)克隆在DCIS向IDC的過渡過程中共同遷移[36]。對癌前、浸潤前和IDC的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析表明，在轉(zhuǎn)錄組水平上，具有相同組織學(xué)分級的浸潤性病變和浸潤性乳腺癌的基因表達(dá)模式極為相似[37]。此外，增殖和凋亡相關(guān)蛋白雌激素受體和孕激素受體在DCIS和IDC的原位和侵襲性成分中有相似的表達(dá)模式，提示可能在轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用[38]。雖然DCIS和IDC在基因上相似，但在匹配的DCIS和IDC之間仍發(fā)現(xiàn)了一些質(zhì)的差異。Kim等[39]通過全外顯子組測序和拷貝數(shù)分析確定了從DCIS到IDC的相關(guān)基因組改變，該研究發(fā)現(xiàn)了一些已知的突變，包括腫瘤蛋白p53基因、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α以及蛋白激酶B1的突變和純DCIS中拷貝數(shù)的改變；但與同步DCIS-IDC相比，檢測到的基因突變與拷貝數(shù)的改變明顯減少。此外，Song等[40]通過分析GSE21422和GSE3893基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)集中DCIS和IDC的基因譜，探討導(dǎo)致DCIS向IDC發(fā)展的基因改變，從中共鑒定出26個(gè)保守的差異表達(dá)基因，其中FCGR2A、主要組織相容性復(fù)合體-DRA、補(bǔ)體成分3a受體1和FYB參與了DCIS向IDC的進(jìn)展，人類白細(xì)胞抗原-DRA和FYB水平升高與乳腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)，且FYB的過度表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些研究表明，至少在某些樣本中，通過達(dá)爾文選擇可能會發(fā)生從DCIS到IDC的進(jìn)展。以上研究提高了人們對DCIS進(jìn)展的認(rèn)識，有助于識別潛在的進(jìn)展標(biāo)志物，尋求新的治療目標(biāo)，從而開發(fā)出一種更加個(gè)性化的DCIS患者治療方法。

4 小 結(jié)

隨著DCIS發(fā)病率的增加,病理工作者需要提供重要病理信息以指導(dǎo)DCIS患者的治療決策，臨床工作者也需要更好地了解DCIS發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，以幫助患者選擇更好的治療方法。從DCIS到IDC的進(jìn)展是一個(gè)非常復(fù)雜的分子事件，深度大規(guī)模平行測序和單細(xì)胞分析不僅提供了基因信息，同時(shí)也提供了一個(gè)詳細(xì)的關(guān)于腫瘤內(nèi)和腫瘤間遺傳異質(zhì)性和腫瘤演變過程的基因圖譜。目前，大規(guī)模平行測序的生物信息工具正在不斷的改進(jìn)，這將有助于從大塊腫瘤群體測序中獲得更加詳細(xì)的信息，為識別體細(xì)胞的點(diǎn)突變提供更靈敏的方法。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)了許多DCIS癌細(xì)胞中基因的改變、癌周環(huán)境的改變以及這些改變間的相互作用,這有助于更好地評估DCIS的發(fā)展,以期找出一個(gè)判斷DCIS是否會發(fā)展為IDC的綜合評定標(biāo)準(zhǔn)，從而指導(dǎo)臨床工作。