劉萬(wàn)立，洪瓊川

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東 珠海 519000； 2.深圳市龍崗中心醫(yī)院心胸外科，廣東 深圳 518116)

肺癌在我國(guó)癌癥中的發(fā)病率和病死率均居首位，每年肺癌發(fā)病人數(shù)約為78.1萬(wàn)，死亡人數(shù)約62.6萬(wàn)[1]。肺癌的病理分型中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占總數(shù)的85%。隨著肺癌早期篩查技術(shù)的普及和治療方式的發(fā)展，1990—2015年男性肺癌患者的病死率下降45%，2002—2015年女性肺癌患者的病死率下降19%[2]。對(duì)于肺癌早期、癌細(xì)胞未轉(zhuǎn)移的患者，外科手術(shù)切除為最佳治療方式?；颊咝g(shù)后5年生存率與肺癌的分期有關(guān)，ⅠA期肺癌患者的5年生存率為90%，Ⅱ期為60%[3-4]。而對(duì)于肺癌分期較差的患者，術(shù)后輔助化療、靶向治療、免疫治療等對(duì)提高患者生存率必不可少[5-6]?？梢?jiàn)，早期篩查、診斷與治療對(duì)于提高肺癌患者的生存率、延長(zhǎng)患者的生存年限至關(guān)重要。因此，尋找一種能夠用于指導(dǎo)肺癌患者全程治療的生物標(biāo)志物非常重要。液體活檢技術(shù)是目前研究的熱點(diǎn)，其是對(duì)循環(huán)血液中的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外泌體和腫瘤相關(guān)血小板進(jìn)行檢測(cè)的一種方法[7]。液體活檢在NSCLC中的應(yīng)用研究以ctDNA研究較為廣泛，現(xiàn)就ctDNA在NSCLC中的應(yīng)用研究進(jìn)展予以綜述。

1 ctDNA的檢測(cè)

ctDNA是一種由腫瘤原發(fā)灶(繼發(fā)灶)釋放入血的腫瘤DNA，其以單鏈DNA、雙鏈DNA、DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物等形式廣泛存在于血液、腦脊液等體液中[8]。目前認(rèn)為，ctDNA主要來(lái)自血液中壞死、凋亡的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的外排體[9-10]。研究表明，腫瘤患者體內(nèi)血漿游離DNA的平均含量約是健康人體的6倍，血液中ctDNA具有含量低、半衰期短等特點(diǎn)，且其絕對(duì)含量會(huì)隨腫瘤負(fù)荷和治療反應(yīng)發(fā)生變化，所以檢測(cè)ctDNA的技術(shù)需要有較高的敏感性和特異性[11]。既往研究報(bào)道了許多不同的檢測(cè)方法，如數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)等通過(guò)定性、定量檢測(cè)循環(huán)DNA的基因突變以確定ctDNA是否存在，這些檢測(cè)方法均存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)[12]。如上海胸科醫(yī)院將NGS用于早期和晚期NSCLC患者的檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用NGS方法檢測(cè)血漿中ctDNA基因突變與術(shù)后病理組織基因突變檢測(cè)的陽(yáng)性符合率早期為44.4%，晚期為71.4%[13]。Newman等[14]報(bào)道了一種癌癥個(gè)體化深度測(cè)序分析方法，該方法在檢測(cè)ctDNA基因突變的敏感性和特異性方面都優(yōu)于之前的檢測(cè)方法。在此基礎(chǔ)上，Newman等[15]又提出一種集成數(shù)字錯(cuò)誤抑制的方法，該方法用于NSCLC患者表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶突變檢測(cè)的靈敏度為92%，特異度為99.99%。隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測(cè)技術(shù)的敏感性和特異性不斷提高，已經(jīng)越來(lái)越接近臨床應(yīng)用水平。

2 ctDNA臨床應(yīng)用

2.1用于肺癌的早期篩查和早期診斷 肺癌早期篩查、早期診斷的方式多種多樣，如低劑量CT、血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等。低劑量CT對(duì)具有高危風(fēng)險(xiǎn)患者的篩查具有較高的敏感性，但同時(shí)也存在較高的假陽(yáng)性率[16]。Patz等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量CT用于肺癌早期篩查的假陽(yáng)性率為96.4%，總體上可能存在18.5%的過(guò)度診斷。目前血清腫瘤標(biāo)志物有癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、細(xì)胞角蛋白19片段、糖類(lèi)抗原、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原等，但上述血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)肺癌進(jìn)行診斷時(shí)的敏感性和特異性均不能滿(mǎn)足臨床需求，因此需要一種特有的、侵入性較低的生物標(biāo)志物取代或作為一種補(bǔ)充方式用于肺癌的早期篩查、早期診斷[18]。而ctDNA在肺癌篩查和早期診斷方面具有較大的潛力。Sozzi等[19]運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)出肺癌患者血漿DNA的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因是正常人的8倍，提示高表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因人群的患癌風(fēng)險(xiǎn)更大。Gautschi等[20]的研究表明，血漿DNA水平與腫瘤的分期有關(guān)。以上研究表明，使用PCR分析技術(shù)對(duì)ctDNA進(jìn)行檢測(cè)可作為識(shí)別肺癌高風(fēng)險(xiǎn)人群的潛在工具。然而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用血漿ctDNA水平的基線(xiàn)評(píng)估并沒(méi)有提高肺癌篩查的準(zhǔn)確性，但血漿ctDNA量化可能起到補(bǔ)充篩查和診斷測(cè)試的作用[21-22]。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究和分子檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)除了對(duì)ctDNA進(jìn)行定量分析外，對(duì)ctDNA上特定的異?；蜻M(jìn)行分析可能會(huì)發(fā)展成為更有前途的肺癌早期篩查與診斷的無(wú)創(chuàng)手段。Chen等[23]通過(guò)測(cè)定58例分期分別為IA、IB和IIA的早期NSCLC患者的腫瘤組織DNA和血漿ctDNA的EGFR基因、鼠類(lèi)肉瘤病毒基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinasecatalytic subunit alpha，PIK3CA)、腫瘤蛋白53基因(tumor protein 53，TP53)等肺癌常見(jiàn)突變基因，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織DNA與血漿ctDNA突變一致率為50.4%，靈敏度為53.8%，特異度為47.3%，血漿陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為53.2%，該研究證實(shí)了檢測(cè)人群中血漿ctDNA突變用于肺癌早期篩查、診斷的可行性。但另一針對(duì)123例健康人群血漿游離DNA檢測(cè)的研究發(fā)現(xiàn)，TP53突變率高達(dá)11.4%，這對(duì)該方法的特異性提出了異議[24]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞在抑癌基因、修復(fù)基因等啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)升高，且抑制了相應(yīng)抑癌基因的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的高甲基化多發(fā)生于啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，而正常細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)的CpG島多處于非甲基化狀態(tài)[25]。Baglietto等[26]抽取吸煙患者的外周血檢測(cè)5個(gè)基因(AHRR、F2RL3、2q37.1、6p21.33、12q14.1)確定了6個(gè)CpGs的甲基化，并發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)這6個(gè)CpGs的甲基化有助于提高對(duì)吸煙患者罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)。一項(xiàng)研究對(duì) 48例Ⅰ期NSCLC患者的ctDNA樣本進(jìn)行了DNA甲基化分析，研究覆蓋了14 500個(gè)基因的啟動(dòng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有379個(gè)基因中的496個(gè)CpGs呈高甲基化狀態(tài)和335個(gè)基因中的373個(gè)CpGs呈低甲基化狀態(tài)[27]。這些研究均證實(shí)了檢測(cè)血液中循環(huán)DNA的甲基化可用于肺癌的早期篩查、早期診斷。目前有學(xué)者對(duì)肺癌患者血漿中單個(gè)或一組抑癌基因的甲基化作為潛在肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物進(jìn)行了評(píng)估，主要包括O-6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、周期素依賴(lài)性蛋白激酶抑制物2A、Ras相關(guān)區(qū)域家族1A、死亡相關(guān)蛋白激酶、視黃酸受體β和人矮小同源盒基因等[28-29]。目前對(duì)于ctDNA的定量分析和特定基因的突變分析，其敏感性和特異性尚未達(dá)到臨床應(yīng)用水平，此外關(guān)于ctDNA的檢測(cè)與其他篩查手段(如低劑量CT、血清腫瘤標(biāo)志物等)相結(jié)合是否能提高診斷敏感性、特異性尚未見(jiàn)報(bào)道，而關(guān)于ctDNA甲基化檢測(cè)能否成為NSCLC早期篩查和診斷的方法尚需大樣本臨床研究結(jié)果證實(shí)。

2.2指導(dǎo)NSCLC患者治療 肺癌的治療從單純的手術(shù)治療、化療發(fā)展到手術(shù)治療、化療、靶向治療和免疫治療相結(jié)合的綜合治療，顯著提高了肺癌患者5年生存率。化療是晚期肺癌最重要的治療手段，但其總體有效率僅為25%～35%，肺癌患者的中位生存期為8～10個(gè)月[30]。隨著21世紀(jì)精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃的提出，精準(zhǔn)醫(yī)療迅速成為醫(yī)藥領(lǐng)域的熱門(mén)話(huà)題[31]。而基因檢測(cè)分型在促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展過(guò)程中起重要作用，在此背景下，肺癌靶向治療的快速發(fā)展為肺癌患者帶來(lái)了新的曙光。然而，靶向治療的前提條件是對(duì)腫瘤進(jìn)行基因分型檢測(cè)，以尋找藥物靶點(diǎn)。

目前，臨床實(shí)踐中大多使用組織活檢的方法獲得腫瘤DNA，實(shí)現(xiàn)基因分型，然而組織活檢只能獲得局部和靜態(tài)的腫瘤信息，且由于腫瘤異質(zhì)性和腫瘤的不斷演變而無(wú)法反映實(shí)時(shí)的腫瘤基因分型，但是通過(guò)ctDNA進(jìn)行基因檢測(cè)分析不僅能夠解決這些問(wèn)題，還能解決病理組織無(wú)法取得或所取組織太少而不能進(jìn)行基因檢測(cè)分型的問(wèn)題，此外ctDNA的半衰期小于2 h，能實(shí)時(shí)反映肺癌在治療過(guò)程中體內(nèi)腫瘤的負(fù)荷情況[32]。Sim等[33]通過(guò)對(duì)晚期NSCLC或一線(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)耐藥患者的總共50份血漿樣品的7個(gè)基因組(BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、NRAS、PIK3CA、PTEN)進(jìn)行深度測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有88%的患者至少發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基因突變位點(diǎn)，50%的患者發(fā)現(xiàn)了至少一個(gè)可行的靶向治療位點(diǎn)。該研究結(jié)果與Thress等[34]的研究結(jié)果相似，表明對(duì)NSCLC患者血液中的ctDNA進(jìn)行測(cè)序?qū)ふ宜幬镏委煱悬c(diǎn)的可能性。與手術(shù)或穿刺獲取病理分型相比，通過(guò)ctDNA測(cè)序獲取藥物治療靶點(diǎn)具有簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于晚期NSCLC患者。隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測(cè)已逐步應(yīng)用于臨床。2016年5月，美國(guó)食品藥品管理局首次批準(zhǔn)了針對(duì)NSCLC患者此類(lèi)液體活檢檢測(cè)試劑盒(CobasVR EGFR Mutation Test v2)的使用，該試劑盒可用作厄洛替尼的伴隨診斷試劑盒[35]；2016年12月，首個(gè)基于NGS檢測(cè)技術(shù)的伴隨診斷試劑盒獲批上市[36]。由此可見(jiàn)，對(duì)血漿ctDNA基因檢測(cè)分析除了能指導(dǎo)NSCLC患者的靶向治療，也將在一定程度上促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。然而，ctDNA測(cè)序能否在臨床應(yīng)用上取代組織病理分型尚需大量研究證實(shí)。

2.3指導(dǎo)耐藥患者藥物的選擇 隨著NSCLC患者靶向治療的興起，靶向藥物耐藥問(wèn)題隨之出現(xiàn)。目前關(guān)于耐藥的研究多集中于NSCLC熱點(diǎn)靶向藥物(以EGFR、間變性淋巴瘤激酶抑制劑為主)，約50%檢測(cè)出EGFR突變的NSCLC患者在使用第一代和第二代EGFR-TKI治療后9～13 個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)耐藥性[37-38]。EGFR-TKI獲得性耐藥患者60%由于第20號(hào)外顯子發(fā)生錯(cuò)義突變(T790M突變)，EGFR T790M被確定為獲得性EGFR-TKI耐藥的最常見(jiàn)機(jī)制，其他機(jī)制還包括間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal epithelial transition factor，MET)擴(kuò)增、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(hepatic growth factor receptor，HGFR)擴(kuò)增等[38-39]。接受第一代和第二代EGFR靶點(diǎn)藥物治療過(guò)程中出現(xiàn)T790M突變的患者，可以改用第三代Osimertinib治療。可見(jiàn)，在靶向藥物治療過(guò)程中需要對(duì)腫瘤進(jìn)行基因檢測(cè)分析以發(fā)現(xiàn)耐藥突變位點(diǎn)，從而調(diào)整治療方案，這就要求NSCLC患者在進(jìn)行靶向治療過(guò)程中需連續(xù)獲取病理組織進(jìn)行基因檢測(cè)分型，以尋找明確獲得性耐藥突變位點(diǎn)。手術(shù)活檢、細(xì)針穿刺活檢是目前常用的獲取病理組織的方式，但這些方法存在風(fēng)險(xiǎn)大、重復(fù)性差、取材過(guò)少不能檢測(cè)等缺點(diǎn)。而抽取患者外周血進(jìn)行ctDNA的基因檢測(cè)分析用于耐藥的監(jiān)控和研究具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其對(duì)不易被活檢或手術(shù)切除腫瘤的肺癌患者有重要價(jià)值。Zheng等[40]連續(xù)監(jiān)測(cè)117例EGFR-TKI獲得性耐藥患者的血漿ctDNA，發(fā)現(xiàn)47%的患者出現(xiàn)EGFR T790M陽(yáng)性。Thress等[41]對(duì)使用奧希替尼治療耐藥的15例患者的血漿ctDNA進(jìn)行基因檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，使用奧希替尼治療前所有患者均存在EGFR T790M突變，使用奧希替尼耐藥后發(fā)現(xiàn)，6例患者獲得了C797S突變，4例失去了T790M突變。以上研究均表明對(duì)于某種藥物耐藥的患者，對(duì)其血液中的ctDNA進(jìn)行檢測(cè)可能會(huì)找到新的藥物靶點(diǎn)，從而指導(dǎo)患者用藥，且有益于對(duì)耐藥機(jī)制的研究。

2.4術(shù)后療效的評(píng)估 對(duì)于早期NSCLC患者，外科手術(shù)切除是最佳手術(shù)治療方式。手術(shù)效果評(píng)估多以切緣的術(shù)中冰凍結(jié)果進(jìn)行判斷，但是術(shù)后患者仍存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，Ⅰ期患者術(shù)后5 年復(fù)發(fā)率為20%，Ⅲ期患者為50%[42]。然而，目前臨床對(duì)于手術(shù)的效果評(píng)估以及術(shù)后是否需要采取輔助化療、靶向治療等沒(méi)有明確的判斷指標(biāo)。一項(xiàng)研究通過(guò)檢測(cè)不同分期的NSCLC患者術(shù)前術(shù)后血漿ctDNA的EGFR、KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA基因突變頻率發(fā)現(xiàn)，91.7%在術(shù)前ctDNA檢測(cè)中出現(xiàn)突變的Ⅰa、Ⅰb期患者的突變頻率在2 d內(nèi)發(fā)生了下降，其平均突變頻率從術(shù)前的8.88%下降為術(shù)后的0.28%，其原因是腫瘤的切除而導(dǎo)致ctDNA的釋放減少；此研究還提出，未來(lái)有希望通過(guò)檢測(cè)患者術(shù)前術(shù)后血漿ctDNA 的突變頻率來(lái)判斷手術(shù)療效[43]。Hu等[44]對(duì)168例肺癌患者術(shù)前、術(shù)后ctDNA進(jìn)行定量分析和基因突變分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后仍能檢測(cè)到ctDNA基因突變或術(shù)后ctDNA水平較高的患者具有更高的復(fù)發(fā)率。該研究表明，在術(shù)后進(jìn)行ctDNA檢測(cè)分析有希望用于手術(shù)療效的評(píng)估以及為術(shù)后患者是否需要行輔助治療提供參考。

另外，手術(shù)切除腫瘤后的微小殘留病灶(minimal residual disease，MRD)作為ctDNA的來(lái)源之一逐漸引起了人們的注意，有報(bào)道稱(chēng)，1例行手術(shù)治療和術(shù)后化療復(fù)發(fā)的患者，在放射性標(biāo)準(zhǔn)診斷復(fù)發(fā)前20個(gè)月就在其ctDNA中檢測(cè)到最小等位基因頻率為 0.04%[45]。隨著ctDNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，更多的低頻突變基因能夠被用于檢測(cè)判定患者體內(nèi)的MRD。有證據(jù)表明，ctDNA可在臨床疾病復(fù)發(fā)之前監(jiān)測(cè)到MRD，如ctDNA在乳腺癌治療后的MRD監(jiān)測(cè)，但這種方法在改善患者預(yù)后方面的價(jià)值需前瞻性介入試驗(yàn)加以證明[39，46]。以上研究均證明了基于目前ctDNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，有望在NSCLC患者術(shù)后通過(guò)對(duì)ctDNA進(jìn)行定量分析或基因突變分析以判斷手術(shù)療效并評(píng)估是否需要術(shù)后輔助治療，以及術(shù)后定期評(píng)估血液中的ctDNA以判斷是否存在分子殘留腫瘤，以達(dá)到早期干預(yù)并提高生存率的目的。

2.5預(yù)后與復(fù)發(fā)的評(píng)估 目前，臨床尚未有明確的指標(biāo)用于評(píng)估NSCLC患者的預(yù)后和復(fù)發(fā)，術(shù)后多使用影像學(xué)檢查隨訪，然而影像學(xué)檢查具有明顯的滯后性和價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。隨著液體活檢的興起，有研究報(bào)道了ctDNA與NSCLC患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的相關(guān)性，如Sozzi等[21]研究證明，肺癌術(shù)后血液中ctDNA 水平較高患者的5年生存率明顯低于血液中循環(huán)ctDNA水平較低的患者。

Chaudhuri等[45]研究表明，肺癌治療后抽取的血液樣本中能檢測(cè)到ctDNA的患者具有較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率，與放射性檢查相比，ctDNA檢測(cè)在評(píng)估術(shù)后復(fù)發(fā)方面具有較高的敏感性，同時(shí)需要進(jìn)一步評(píng)估是否存在過(guò)度治療。一項(xiàng)大樣本的前瞻性研究也證明了術(shù)后30 d患者ctDNA中KRAS和EGFR突變的水平也可以作為評(píng)估預(yù)后的參考值[44]。也有研究表明，在靶向治療過(guò)程中，通過(guò)檢測(cè)血漿ctDNA而出現(xiàn)獲得性耐藥基因突變的患者，其中位生存期明顯短于突變陰性的患者[47]。隨著研究的深入，ctDNA的檢測(cè)有望在NSCLC患者的預(yù)后和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。

3 小 結(jié)

基于液體活檢技術(shù)的快速發(fā)展，ctDNA作為無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物正逐步應(yīng)用于臨床。ctDNA的檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，可在NSCLC患者的早期診斷、指導(dǎo)治療和評(píng)估預(yù)后等方面發(fā)揮出巨大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著“精準(zhǔn)醫(yī)療”方法的提出，將ctDNA作為基因水平的標(biāo)志物是未來(lái)重要發(fā)展方向。但是存在ctDNA的檢測(cè)無(wú)統(tǒng)一的定量標(biāo)準(zhǔn)、不同的檢測(cè)方法差異較大等問(wèn)題，且目前尚無(wú)大樣本臨床研究數(shù)據(jù)證明，ctDNA可以直接應(yīng)用于臨床。將來(lái)隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究和分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測(cè)有望真正運(yùn)用于肺癌的臨床診療。