陳麗鵑，俞婷婷，單莉

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，烏魯木齊 830000)

T790M突變是第一代和第二代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)最常見的耐藥機(jī)制。第三代EGFR-TKI是不可逆小分子抑制劑，目前正處于臨床試驗(yàn)中，與其他不可逆EGFR-TKI相同，不可逆地與ATP結(jié)合位點(diǎn)上的半胱氨酸-797殘基結(jié)合。Simertinib是美國食品藥品管理局唯一批準(zhǔn)的用于攜帶表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)T790M突變的晚期肺癌患者的藥物。Simertinib苯胺嘧啶支架更適應(yīng)T790M突變后的構(gòu)象，因此Simertinib靶向針對(duì)EGFR T790M突變較WT EGFR(EGFR野生型)更特異，與T790M突變體的結(jié)合力是WT EGFR的100～200倍[1-3]。與第一、二代EGFR-TKI相比，第三代EGFR-TKI抑制EGFR T790M突變的臨床療效更高。目前關(guān)于T790M靶向第三代EGFR-TKI臨床試驗(yàn)包括AZD9291(Osimertinib、Mereletinib、Tagrisso)、CO-1686(Rociletinib)、HM61713(Olmutinib)、ASP8273(Naquotinib)、EGF816以及PF-06747775等[4-5]。AZD9291對(duì)EGFR-T790M陽性非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的有效率約為61%[6]。800 mg/d的HM61713對(duì)EGFR-T790M陽性NSCLC患者的有效率為58.8%[7]。但口服第三代EGFR-TKI肺癌患者在用藥約10個(gè)月后不可避免地產(chǎn)生耐藥。了解第三代EGFR-TKI的耐藥機(jī)制對(duì)于制訂后續(xù)治療策略至關(guān)重要。有研究報(bào)道，位于酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的EGFR Cys797Ser(C797S)突變是T790M陽性患者使用第三代EGFR-TKI后產(chǎn)生耐藥的機(jī)制[8]，此后多個(gè)研究機(jī)構(gòu)相繼報(bào)道了第三代EGFR-TKI的多種可能耐藥機(jī)制?，F(xiàn)就第三代EGFR-TKI獲得性耐藥的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 第三代EGFR-TKI耐藥機(jī)制

1.1C797S突變 C797S是EGFR與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的不可逆EGFR-TKI共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。因此，C797S位點(diǎn)突變很有可能導(dǎo)致第三代EGFR-TKI的獲得性耐藥。EGFR單獨(dú)位點(diǎn)突變，如在19外顯子缺失或21 L858R突變或EGFR-T790M突變的細(xì)胞系和移植瘤模型中，C797S突變導(dǎo)致模型對(duì)AZD9291、CO-1686、HM61713耐藥。既往報(bào)道，使用第三代EGFR-TKI治療的T790M突變的NSCLC患者，19%以上再次出現(xiàn)耐藥是因?yàn)镃797S突變，而對(duì)CO-1686耐藥的比例低于3%[1]。目前在臨床耐藥病例中，不同突變類型患者發(fā)生C797S突變的概率也不同[9-11]。以上證據(jù)表明，第三代EGFR-TKI的耐藥機(jī)制可能因藥物和突變類型的不同而不同。

1.1.1C797S介導(dǎo)對(duì)AZD9291的耐藥 大部分第三代EGFR-TKI與ATP半胱氨酸位點(diǎn)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，而C797S突變點(diǎn)位于EGFR第20外顯子中，將半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸，是目前口服Osimertinib再次出現(xiàn)耐藥最常見的機(jī)制[8,12-13]。體外研究證明，第一代和第三代EGFR-TKI C797S突變存在順式和反式，C797S等位基因突變存在T790M反式中，而不是順式中[14]。Ercan等[15]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C797S發(fā)生反式突變時(shí)，細(xì)胞對(duì)Osimertinib產(chǎn)生耐藥，而對(duì)吉非替尼、阿法替尼等喹唑啉類EGFR-TKI敏感，所以治療上可采用第一代和第三代EGFR-TKI序貫療法，如Osimertinib+吉非替尼或鹽酸厄洛替尼序貫治療。當(dāng)C797S發(fā)生順式突變時(shí)，細(xì)胞對(duì)目前所有EGFR-TKI，甚至聯(lián)合用藥耐藥[16]。一項(xiàng)前瞻性二代測序分析研究顯示，循環(huán)腫瘤DNA樣本中82%為T790M順式C797S、10%為反式，6%為孤立突變,2%機(jī)制不明[17]。該研究認(rèn)為，T790M的丟失并不意味著對(duì)第一代TKI的再敏化，往往意味著競爭性突變位點(diǎn)(如KRAS突變、RET融合、FGFR融合)的過度表達(dá)。該項(xiàng)研究還指出，口服Osimertinib的有效時(shí)長與預(yù)測耐藥機(jī)制相關(guān)，如早期耐藥往往與T790M的丟失和競爭耐藥有關(guān)，而晚期耐藥與持續(xù)的EGFR成癮有關(guān)[17]。

1.1.2C797S突變介導(dǎo)對(duì)HM61713的耐藥 HM61713是另一種口服的選擇性EGFR-TKI，作為另一種第三代EGFR-TKI，其與突變的EGFR激酶結(jié)構(gòu)域附近的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合[13]。既往Ⅰ/Ⅱ期研究顯示，HM61713對(duì)T790M突變陽性的NSCLC患者有效[18-20]。對(duì)HM61713耐藥的第1個(gè)病例報(bào)道是1例57歲從未吸煙，基因檢測提示攜帶EGFR 19 del的Ⅳ期肺腺癌女性患者。患者口服吉非替尼耐藥，再次行基因檢測時(shí)出現(xiàn)T790M突變。然后該患者參加了HM61713試驗(yàn)，并于17個(gè)月后全面進(jìn)展。進(jìn)展后對(duì)該患者進(jìn)行重復(fù)活檢發(fā)現(xiàn)，除EGFR T790M突變和19外顯子缺失外,還存在C797S突變[21]。因此，獲得性C797S突變可能是另一個(gè)第三代EGFR-TKI HM61713的耐藥機(jī)制。

1.2G796D突變 G796D突變是一個(gè)新的突變機(jī)制。Zheng等[22]在1例中國NSCLC患者中檢測到了EGFRG796D，通過搜集該患者口服吉非替尼前、局部進(jìn)展后再次組織活檢檢出T790M突變；口服Osimertinib局部進(jìn)展后，對(duì)細(xì)胞游離DNA序列進(jìn)行動(dòng)態(tài)基因組分析發(fā)現(xiàn)，EGFR G796D突變是Osimertinib的一種新的耐藥機(jī)制。體外研究證明，G796D陽性細(xì)胞多數(shù)在T790M陽性克隆被Osimertinib削弱后才出現(xiàn)[15,22-23]。故G796D突變可能是Osimertinib產(chǎn)生耐藥的另一機(jī)制，但缺乏進(jìn)一步研究支持。

1.3EGFR G724S EGFR G724S突變是非常罕見的驅(qū)動(dòng)突變。為評(píng)估獲得性EGFR G724S突變的總體頻率和EGFR的其他變化，F(xiàn)assunke等[24]在4例T790M陽性肺腺癌患者使用第三代EGFR-TKI前進(jìn)行基因檢測，其中2例未檢測到的EGFR G724S突變、2例低水平EGFR G724S突變。使用Osimertinib治療8.2個(gè)月全面進(jìn)展后，在患者的胸腔積液中檢測到EGFR T790M陰性和EGFR G724S陽性。通過結(jié)構(gòu)分析和計(jì)算模型發(fā)現(xiàn)，EGFR G724S突變可能誘導(dǎo)富含甘氨酸環(huán)的構(gòu)象，體內(nèi)外試驗(yàn)均證明EGFR G724S可限制第三代EGFR-TKI的活性[23,25]。另外，有研究通過系統(tǒng)性抑制劑篩選和深入動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，第二代EGFR-TKI保留了激酶親和力并克服了EGFR G724S介導(dǎo)的耐藥性。

綜上所述，隨著第三代EGFR-TKI的廣泛應(yīng)用，耐藥的出現(xiàn)不可避免，除以上提到的耐藥機(jī)制外，還包括Src-家族酪氨酸激酶、肉瘤病毒同源物癌基因1擴(kuò)增[26-27]、T790M減弱、RAS-促分裂原活化的蛋白酶活化、張力蛋白同源物缺失、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α活化突變等。了解以上機(jī)制可為第四代EGFR-TKI的開發(fā)提供參考[28]。

2 其他第三代EGFR-TKI的耐藥機(jī)制

2.1關(guān)于EGFR L718Q、EGFR L844V耐藥突變 早期為了在EGFR基因中尋找獲得性耐藥突變，Dana Farber癌癥中心的一組研究人員利用具有EGFR 致敏突變伴或不伴T790M突變的EGFR突變體在Ba/F3細(xì)胞系中進(jìn)行定點(diǎn)誘變,然后用第三代EGFR-TKI、WZ4002、CO-1686、AZD9291處理細(xì)胞，選擇耐藥細(xì)胞進(jìn)行克隆，并進(jìn)行突變鑒定。該研究鑒定出3種主要的耐藥突機(jī)制，分別為EGFR L718Q、EGFR L844V和C797S[15]。EGFR L718Q和EGFR L844V可能是另外兩個(gè)導(dǎo)致第三代EGFR-TKI耐藥的突變機(jī)制[29]。體外研究表明，與C797S不同，突變體EGFR L718Q和EGFR L844V僅對(duì)WZ4002和CO-1686耐藥，對(duì)AZD9291、吉非替尼和阿法替尼相對(duì)敏感。三聯(lián)突變EGFR/T790M/L718Q或EGFR/T790M/L844V對(duì)WZ4002和CO-1686耐藥，但是只有C797S突變導(dǎo)致了AZD9291(即Osimertinib)耐藥[30]。在存在19del/L858R和T790M突變的情況下，C797S突變將導(dǎo)致患者對(duì)所有EGFR-TKI耐藥(吉非替尼、Afatinib、WZ4002、CO-1686和AZD9291)，但L858R/T790M/C797S突變體對(duì)西妥昔單抗保持部分敏感，為開發(fā)L858R/T790M/C797S突變體克隆的NSCLC的治療藥物提供指導(dǎo)[31]。

2.2CO-1686相關(guān)耐藥機(jī)制 EGFR T790M L798I是一種新發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致CO-1686耐藥的機(jī)制，該機(jī)制通過形成氫鍵干擾EGFR中Asp800殘基與CO-1686結(jié)合，從而影響藥物與EGFR結(jié)合的穩(wěn)定性。除C797S外，可與C797S突變?cè)诘任换蛏瞎泊娴腉796S/R、L792F/Y/H突變被報(bào)道為CO-1686等第三代EGFR-TKI新的耐藥機(jī)制。G796S/R突變占據(jù)CO-1686芳香環(huán)上的位置，使藥物不能與EGFR結(jié)合。而L792F/Y/H突變可通過空間結(jié)構(gòu)立體影響甲氧基,從而影響EGFR-TKI上的苯環(huán)，使藥物無法定位的與EGFR結(jié)合[10,24,32]。

2.3MET擴(kuò)增及人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)擴(kuò)增所致耐藥機(jī)制 據(jù)報(bào)道，Rociletinib和Osimertinib的主要耐藥機(jī)制不同，MET擴(kuò)增是最常見的Rociletinib的耐藥機(jī)制。Ichihara等[26]為了研究Rociletinib的耐藥機(jī)制，篩選出43例在使用Rociletinib治療前不存在，但在進(jìn)展時(shí)或治療過程中出現(xiàn)MET相對(duì)豐度增加的患者，其中28例患者出現(xiàn)多種耐藥。研究認(rèn)為MET擴(kuò)增是Rociletinib最常見的耐藥機(jī)制，相當(dāng)一部分患者對(duì)Rociletinib產(chǎn)生多種耐藥[33]。在一項(xiàng)病例報(bào)道中，1例54歲Ⅳ期肺腺癌男性患者在用吉非替尼二線治療進(jìn)展后獲得T790M突變，后在AURA 試驗(yàn)中使用AZD9291治療12個(gè)月后疾病出現(xiàn)進(jìn)展，在未檢測到C797S突變的情況下檢測出HER2擴(kuò)增[7]。La Monica等[34]發(fā)現(xiàn)，HER2過表達(dá)能顯著降低Osimertinib的敏感性，與單一用藥相比，HER2抑制劑聯(lián)合Osimertinib能顯著延緩小鼠腫瘤的生長。因此HER2擴(kuò)增除可導(dǎo)致第一代和第二代EGFR-TKI耐藥外，在CO-1686或AZD9291等治療后病情進(jìn)展的T790M突變患者中，HER2擴(kuò)增將近10%[35]。采用HER2抑制劑治療第三代EGFR-TKI耐藥的患者可能是一個(gè)新的研究方向。

3 第三代EGFR-TKI耐藥后治療策略

3.1EAI045 EGFR變構(gòu)抑制劑-1(EAI045)目前正作為解決Osimertinib耐藥的第四代靶向藥物進(jìn)行研發(fā)。既往Jia等[2]利用含有L858R/T790M突變的純化EGFR突變激酶肽篩選針對(duì)EGFR突變體的選擇性抑制劑EAI001，通過化學(xué)藥物進(jìn)一步優(yōu)化，得到對(duì)L858R/T790M突變體高選擇性抑制的EAI045，但不包括野生型受體。EAI045抑制具有低納摩爾效力的L858R/T790M-EGFR突變，但作為單一藥劑，該藥對(duì)L858R/T790M突變體受體的兩個(gè)亞基效應(yīng)不同，因此在阻斷EGFR驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖方面無效[12,17]。也有報(bào)道，EAI045與西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)阻斷EGFR二聚體化有顯著的協(xié)同作用，在由EGFR(L858R/T790M)和EGFR(L858R/T790M/C797S)驅(qū)動(dòng)的小鼠肺癌模型中有效[15]。有研究人員假設(shè)EAI045對(duì)EGFR異二聚體/不對(duì)稱二聚體的一個(gè)亞基有活性，證實(shí)了二聚體缺陷/獨(dú)立突變體對(duì)EAI045敏感，當(dāng)與阻斷EGFR二聚化的西妥昔單抗聯(lián)合時(shí)，EAI045在L858R/T790M突變體驅(qū)動(dòng)的肺癌小鼠中顯著延緩了腫瘤的生長[2]。單獨(dú)采用EAI045治療的小鼠無反應(yīng)[2]。L858R/T790M/C797S是已知的，對(duì)所有第三代EGFR-TKI具有耐藥性的突變體，EAI045與西妥昔單抗聯(lián)合也能顯著誘導(dǎo)攜帶L858R/T790M/C797S的腫瘤縮小[36-37]。EAI045和西妥昔單抗表現(xiàn)出機(jī)械協(xié)同作用，可作為一種新的可以克服T790M和C797S耐藥突變的選擇性治療方案。

3.2Brigatinib Brigatinib由一組以u(píng)型構(gòu)象圍繞雙苯胺嘧啶支架構(gòu)建的二甲氧基，目前正作為間變性淋巴瘤激酶抑制劑進(jìn)行開發(fā)。Zhao等[38]報(bào)道1例66歲無吸煙史的女性右肺伴有縱隔中央低分化腺癌，該患者一線接受吉非替尼、二線接受Osimertinib治療后再次出現(xiàn)局部進(jìn)展，通過循環(huán)腫瘤DNA檢測到了T790M/L858R/C797S突變，在既往研究的基礎(chǔ)上予以O(shè)simertinib聯(lián)合貝伐珠單抗及Brigatini治療，結(jié)果提示治療有效且未見明顯毒副反應(yīng)。Uchibori等[18]發(fā)現(xiàn)，Brigatinib在重點(diǎn)藥物篩選方案中對(duì)三重突變(C797S/T790M/del19)有效，并證實(shí)其在體內(nèi)和體外測定中的活性。但仍缺乏臨床試驗(yàn)支持，具體效果需要廣大醫(yī)務(wù)人員驗(yàn)證。

3.3Pembrolizumab Pembrolizumab是程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1,PD-1)的抑制劑。研究表明，PD-1抑制劑對(duì)于EGFR突變者的療效低于野生型EGFR患者，EGFR突變者高表達(dá)程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)較少見，PD-L1在腫瘤組織中的表達(dá)可以被認(rèn)為是PD-1抑制劑功效的預(yù)測因素[39-40]。Tozuka等[41]報(bào)道1例右肺腺癌患者行右中、下肺葉切除術(shù)聯(lián)合系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術(shù)，手術(shù)切除肺組織中PD-L1的表達(dá)率為25%；術(shù)后1年復(fù)發(fā)，接受化療和EGFR-TKI(吉非替尼+Osimertinib)治療，當(dāng)患者再次進(jìn)展行組織活檢發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)率增加至90%，并開始接受Pembrolizumab聯(lián)合吉西他濱治療，最佳反應(yīng)定義為疾病穩(wěn)定，無進(jìn)展生存期為4個(gè)月。提示細(xì)胞毒性化療和EGFR-TKI治療可能影響PD-L1的表達(dá)，其有可能成為第三代EGFR-TKI耐藥后的下一步治療方法。在另一項(xiàng)報(bào)道中，1例患者先后獲得EGFR19del、EGFRT790M突變、C797S突變，使用6個(gè)周期Pembrolizumab治療后再次行基因檢測，EGFR19del、EGFRT790M突變持續(xù)存在，C797S突變消失，用Osimertinib再治療最佳療效可達(dá)完全緩解。該患者在獲得C797S突變后行全身治療后恢復(fù)對(duì)Osimertinib敏感性。PD-L1高表達(dá)是免疫抑制劑如Pembrolizumab和Nivolumab重要的用藥指標(biāo)，在EGFR突變體中以相對(duì)較低的頻率發(fā)生[5,42]。然而在此案例中，所示患者在全身治療后恢復(fù)對(duì)Osimertinib的敏感性，反映出腫瘤異質(zhì)性群體的存在。以上病例強(qiáng)調(diào)，肺癌患者的基因型突變?cè)诟鼡Q藥物治療的同時(shí)會(huì)發(fā)生改變，故臨床上有必要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測肺癌患者的基因突變譜，這可能有助于確定適當(dāng)?shù)暮罄m(xù)治療。

3.4EGFR-TKI OBX1-012 EGFR-TKI OBX1-012用于治療T790M突變導(dǎo)致的NSCLC耐藥。Kim等[43]發(fā)現(xiàn)，與其他突變選擇性EGFR-TKI相比，EGFR-TKI OBX1-012可選擇性靶向針對(duì)EGFR的突變體，如EGFR19del、EGFR21L858R突變。OBX1-012在體內(nèi)外對(duì)于有或沒有EGFR T790M的EGFR突變肺癌模型有效，但通過定點(diǎn)誘變和Ba/F3細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，OBX1-012與其他EGFR-TKIs一樣，未能顯示對(duì)外顯子20插入突變或C797S突變的功效[41]。

4 小 結(jié)

臨床試驗(yàn)已證實(shí)了第三代EGFR-TKI在T790M突變陽性肺癌患者中的有效性和安全性，但臨床數(shù)據(jù)顯示，雖然以O(shè)simertinib為代表的第三代EGFR-TKI雖然延長了疾病的無進(jìn)展生存期，客觀緩解率、疾病控制率均有了顯著改善,但第三代EGFR-TKI與第一代、第二代相同也會(huì)發(fā)生耐藥并限制其用藥效果。獲得性耐藥是限制EGFR突變NSCLC患者靶向治療長期有效的主要原因。了解不可逆第三代EGFR-TKI的耐藥機(jī)制對(duì)后續(xù)治療的選擇具有重要意義，關(guān)于第三代EGFR-TKI耐藥的機(jī)制現(xiàn)已成為靶向治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，如常見的EGFR L718Q、L844V和C797S突變，其他耐藥機(jī)制如HER2和MET擴(kuò)增、EGFR G724s、G796D突變、BRAF V600E[14]?？梢詫?duì)抗第三代靶向藥物耐藥的臨床用藥目前也正在研究中，EAI045、Brigatinib、Pembrolizumab、EGFR-TKI OBX1-01等藥物均有潛力成為未來第四代EGFR-TKI，但關(guān)于這些藥物的研究基本都處于臨床前期。第三代靶向藥物帶來臨床獲益的同時(shí)，為了能延長患者的生存期、提高患者的生存質(zhì)量，非常有必要開發(fā)針對(duì)第三代EGFR-TKI耐藥的第四代抑制劑。