虞隨，嚴澤軍

(1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211； 2.寧波市第一醫(yī)院泌尿外科，浙江 寧波 315010)

文獻報道，2018年美國膀胱癌新增發(fā)病人數(shù)為81 190人，居惡性腫瘤發(fā)病的第六位，死亡人數(shù)為17 240人，居惡性腫瘤死亡的第八位，且膀胱癌在男性泌尿系惡性腫瘤中發(fā)病率最高，居惡性腫瘤發(fā)病率第三位[1]。在我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中，膀胱癌的發(fā)病率和死亡率均居第一位[2]。Ashworth[3]于1969年首次報道了癌癥患者血液中循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)的存在。但局限于當(dāng)時的科技水平，CTC檢測未得到廣泛應(yīng)用。近年來，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念的推動下，CTC檢測正逐漸被認知，因其檢測速度快、創(chuàng)傷小、靈敏度高、特異性強，并與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，故在臨床運用中發(fā)揮出巨大價值。截至目前，已有超過50種CTC檢測方法，其中CellSearch?系統(tǒng)是CTC檢測的唯一標(biāo)準(zhǔn)化平臺，已獲得美國食品藥品管理局批準(zhǔn)，用于分析轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌患者的血液[4]。一項薈萃分析表明，外周血中CTC的存在是膀胱癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)，可用于膀胱癌診斷[5]。目前，CTC檢測在膀胱癌的診療中已逐步開展并顯示出巨大潛力。現(xiàn)就CTC檢測在膀胱癌診療中的研究進展予以綜述。

1 CTC概述

1.1生物學(xué)特征 CTC是指從原發(fā)病灶脫落進入血液循環(huán)并與原發(fā)灶腫瘤細胞具有相似抗原和遺傳特性的細胞。CTC的形成過程非常復(fù)雜，包括腫瘤細胞自身改變、從原發(fā)灶脫落、進入血管、逃過宿主免疫系統(tǒng)及避免血流剪切力、從血液循環(huán)中溢出、在繼發(fā)部位種植增殖[6]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化被認為是其中最重要的步驟，通過修飾腫瘤細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、黏附分子及其骨架結(jié)構(gòu)，使腫瘤細胞黏附能力下降、可塑性增強，造成腫瘤細胞脫落，腫瘤細胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶則使得其遷移能力增強，從而使腫瘤細胞播散、遷移進入血液循環(huán)[7]。CTC是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最直接因素[8]，然而CTC占所有單核血細胞的比例不到0.004%[9]。由于CTC的稀缺性，對單個細胞進行濃縮、檢測、鑒定和分析需要精細的技術(shù)，這增加了臨床實踐中實施CTC檢測標(biāo)準(zhǔn)化的難度[10]。

1.2檢測方法 目前已有許多分離檢測CTC的方式，但膀胱癌中的大多數(shù)CTC研究依賴于CellSearch?系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用陽性富集技術(shù)，通過捕獲上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM) 陽性CTC，能夠捕獲到血液中的上皮型、上皮-間充質(zhì)混合型CTC，是唯一被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于CTC檢測的標(biāo)準(zhǔn)化平臺[4]。已有文獻證實，膀胱切除標(biāo)本中96%的膀胱腫瘤表達EpCAM[11]。然而CellSearch?系統(tǒng)存在一定缺陷，其測定可能無法檢測出失去EpCAM和(或)肌酸激酶表達的細胞，而這些細胞常在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化期間產(chǎn)生。在膀胱癌和其他實體惡性腫瘤中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程至關(guān)重要[12-13]。但目前尚未有任何儀器能夠檢測到經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的細胞。因此，獨立于EpCAM表達的CTC捕獲的測定，如針對細胞大小、形態(tài)、密度和電荷可能是新的研究方向[14]。與CellSearch?系統(tǒng)不同，AdnaTest?系統(tǒng)不完全依賴于EpCAM陽性CTC，還可檢測其他上皮標(biāo)志物，如表皮生長因子受體和人表皮生長因子受體-2，已被運用于膀胱癌的檢測[15]。而Chalfin等[14]使用新型無選擇AccuCyte-CyteFinder系統(tǒng)，對膀胱癌患者一系列階段中的CTC進行計數(shù)和標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，這種無選擇方法能夠識別EpCAM陽性以及EpCAM陰性CTC。利用這種新方法，可以在非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)患者中檢測到使用CellSearch?系統(tǒng)檢測可能遺漏的EpCAM陰性CTC。另外，Ajjai等[16]發(fā)現(xiàn)，與CellSearch?系統(tǒng)相比，使用IsoFlux方法在膀胱癌中檢測CTC具有更高的敏感性；在匹配的9例樣本中，IsoFlux測試顯示4例樣本(44%)中有10個或更多CTC，而使用CellSearch?系統(tǒng)在所有樣本中均未檢測出。

一項針對膀胱癌患者的薈萃分析提示，CTC的總體靈敏度和特異度分別為0.35(95%CI0.28～0.43)和0.97(95%CI0.92～0.99)，陽性似然比和陰性似然比分別為11.2(95%CI4.5～27.5)和0.67(95%CI0.60～0.76)，診斷比值比為17(95%CI6～43)[5]。由于目前各種檢測CTC的技術(shù)均存在其優(yōu)缺點，故將不同的檢測方法聯(lián)合能提高CTC檢測的敏感性和特異性。同時，亟需進一步開發(fā)敏感性和特異性更高的CTC檢測技術(shù)。

2 CTC在膀胱癌診治中的應(yīng)用

2.1診斷 研究表明，外周血CTC檢測有助于膀胱癌患者的診斷[17-18]。Naoe等[17]首次報道了使用CellSearch?系統(tǒng)檢測膀胱癌患者外周血中的CTC。該研究通過對14例轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者的外周血進行檢測發(fā)現(xiàn)，8例(57%)患者外周血存在CTC，而另外12例非轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者的外周血中均未檢測到CTC，提示膀胱癌可能具有轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。Gazzaniga等[18]報道了CTC陽性患者與腫瘤T1分期之間存在關(guān)聯(lián)，而在所有Ta分期疾病中均未檢測到CTC，這從生物學(xué)的角度證實了Ta和T1分期腫瘤存在差異。

CTC還可以指導(dǎo)腫瘤分期，CTC計數(shù)越高，其分期越高。有薈萃分析顯示，外周血CTC陽性與膀胱癌腫瘤分期、組織學(xué)分期、轉(zhuǎn)移和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。這表明，CTC在TNM分期更高的癌癥中更容易被檢測到。而在其他腫瘤的分期中，CTC已表現(xiàn)出較高的臨床價值。美國癌癥聯(lián)合委員會在2010年制訂的《腫瘤分期指南》中，首次將CTC列入乳腺癌TNM分期系統(tǒng)，作為一個新的M分期標(biāo)準(zhǔn)，列為cM0(i+)分期，出現(xiàn)在M0和M1之間[19]。cM0(i+)分期定義為：無任何轉(zhuǎn)移性臨床癥狀或體征，無遠處轉(zhuǎn)移的臨床或影像學(xué)證據(jù)，但通過分子檢測或顯微鏡檢，在循環(huán)血液、骨髓或其他非區(qū)域淋巴結(jié)組織中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞或≤0.2 mm的微小轉(zhuǎn)移灶。同時指南認為，cM0(i+)并不改變TNM分期。美國癌癥聯(lián)合委員會第8版乳腺癌分期系統(tǒng)再次肯定了CTC的意義，認為臨床晚期乳腺癌患者外周血CTC≥5個/7.5 mL，臨床早期乳腺癌患者外周血CTC≥1個/7.5 mL提示預(yù)后不良，證據(jù)水平為Ⅱ級[20]。

可見，CTC有潛力彌補和完善現(xiàn)有傳統(tǒng)膀胱腫瘤TNM分期的不足，通過檢測CTC的狀態(tài)能進一步明確膀胱腫瘤分期，提示早期微轉(zhuǎn)移的存在風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床調(diào)整診療策略，制訂更加合理的個體化診療方案(進一步篩查轉(zhuǎn)移、擬定新輔助化療、輔助化療方案等)。然而在膀胱癌的TNM分期中，CTC的應(yīng)用價值尚未見報道。目前缺乏前瞻性研究證明CTC可以幫助臨床醫(yī)師在膀胱癌中進行更精確的TNM分期，有待進一步研究。

2.2治療 根治性膀胱切除術(shù)聯(lián)合盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)是MIBC和反復(fù)復(fù)發(fā)的NMIBC治療的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，膀胱切除術(shù)對于超過50%的晚期或伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者療效欠佳[11，21]。大多數(shù)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者在根治性膀胱切除術(shù)后的兩年內(nèi)復(fù)發(fā)[22]，表明在手術(shù)治療前使用常規(guī)分期技術(shù)無法檢測到早期微轉(zhuǎn)移，而這可能導(dǎo)致膀胱癌的復(fù)發(fā)[23]。雖然圍手術(shù)期全身化療的療效存在爭議，但仍有學(xué)者建議將其用于高危疾病復(fù)發(fā)的患者[24-25]。而CTC的存在與無病生存率、癌癥特異性存活率(cancer-specific survival，CSS)和總生存率(overall survival，OS)顯著相關(guān)，因此CTC不僅可以幫助臨床醫(yī)師選擇最適合輔助化療的患者，而且還可以識別可能僅通過局部療法治愈的患者，從而減輕醫(yī)療負擔(dān)。此外，CTC是隨訪或治療期間疾病監(jiān)測的重要方式，證實在膀胱癌患者中存在化療耐藥亞群，這可能決定著膀胱癌患者對化療的反應(yīng)[26]。同時，CTC已被證明可用于預(yù)測卡介苗治療的高風(fēng)險NMIBC患者的局部復(fù)發(fā)時間和進展時間[27]。

Anantharaman等[28]在一項針對轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，肌酸激酶陽性和肌酸激酶陰性CTC中均存在程序性死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)表達，其基因組分析支持其腫瘤起源。該方法強調(diào)了CTC亞群的異質(zhì)分子性質(zhì)，可能具有臨床意義。細胞表面的PD-L1表達可能是CTC能夠逃脫免疫監(jiān)視的一系列分子機制的原因之一。而對于PD-L1+CTC亞群，可以選擇使用抗PD-L1免疫療法[29]。目前尚無明確證據(jù)表明，與沒有PD-L1表達的CTC陽性患者相比，表達PD-L1的CTC患者可能是更好的免疫治療候選者。

以上研究表明，檢測膀胱癌患者外周血中的CTC可進一步評估化療和靶向治療在細胞水平上的療效，從而有助于指導(dǎo)臨床治療。

而在手術(shù)方式選擇中，CTC檢測也有望發(fā)揮更大的診治價值。目前經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(transurethral resection of bladder tumor，TURBT)是治療NMIBC的金標(biāo)準(zhǔn)，然而Engilbertsson等[30]在研究中發(fā)現(xiàn)行TURBT可能會導(dǎo)致癌細胞入血。因此他們建議，應(yīng)開展經(jīng)尿道治療膀胱腫瘤的新技術(shù)，最好在可能的情況下將腫瘤整塊切除。Blaschke等[31]為了進一步確定TURBT對CTC產(chǎn)生的影響，選取了8例經(jīng)超聲和(或)膀胱鏡檢查懷疑膀胱癌的患者，在TURBT發(fā)生前后立即采集血樣，使用CellSearch?系統(tǒng)對每例患者TURBT前后的樣本進行CTC計數(shù)。結(jié)果顯示，8例患者中有7例經(jīng)組織病理學(xué)證實為膀胱癌，其中3例患者為T2分期腫瘤，2例患者為T1分期腫瘤，2例患者為Ta分期腫瘤。在2例高級別T2分期腫瘤患者中，CTC在TURBT后可檢測到，但在TURBT前不能檢測到，其中1例患者存在大量腫瘤細胞擴散；而在所有不同分期低級別腫瘤患者和1例高級別T1分期腫瘤患者中均未檢測到CTC，證實TURBT可能導(dǎo)致系統(tǒng)性腫瘤細胞擴散入血，且在高分期和高級別膀胱癌患者中尤為顯著。同時該研究提示，臨床可通過術(shù)前術(shù)后CTC檢測對比選擇更好的手術(shù)方式，但還需進一步的大樣本前瞻性研究驗證。

2.3預(yù)后 晚期膀胱癌復(fù)發(fā)率高、進展快、對化療反應(yīng)差以及缺乏新的靶向治療[32]，因此治療難度較大。此外，腫瘤的異質(zhì)性對于腫瘤的治療也有影響，由于腫瘤的高分子異質(zhì)性，即使組織學(xué)上相似的腫瘤，其治療結(jié)果也存在顯著差異[33]。由于缺乏有效的隨訪方式，特別是缺乏非侵入性診斷、實時治療反應(yīng)監(jiān)測、轉(zhuǎn)移風(fēng)險評估和隱匿性微轉(zhuǎn)移的早期檢測，晚期膀胱癌患者的預(yù)后往往更差。

膀胱癌根據(jù)腫瘤是否侵犯肌層，分為NMIBC和MIBC。其中，NMIBC占75%以上[34]。雖然NMIBC被認為是一種非侵襲性腫瘤，但其復(fù)發(fā)風(fēng)險高達78%，進展風(fēng)險高達45%，保守治療及保留膀胱治療后的癌癥死亡率為16%～23%[31]。為了研究CTC檢測在NMIBC患者中的潛在預(yù)后價值，Gazzaniga等[18]證實，CTC的存在與疾病復(fù)發(fā)的時間相關(guān)。在44例NMIBC患者中，有8例檢測到CTC，平均首次復(fù)發(fā)時間為6.5個月，而在未檢測到CTC的患者中，平均首次復(fù)發(fā)時間為21.7個月(P<0.001)；8例CTC陽性的患者中有7例在24個月的隨訪中局部復(fù)發(fā)并進展為MIBC，而36例CTC陰性的患者，只有13例局部復(fù)發(fā)，且沒有進展為MIBC。這表明，CTC計數(shù)與預(yù)后相關(guān)，計數(shù)越高，提示預(yù)后越差。因此通過CTC檢測，能夠幫助患者更早發(fā)現(xiàn)膀胱癌的復(fù)發(fā)及進展，從而更及時地實施疾病的治療和監(jiān)測。

高級別T1分期膀胱癌是NMIBC的最高風(fēng)險亞型，其5年復(fù)發(fā)率接近40%，5年進展率為20%[35]。然而，目前沒有特異性標(biāo)志物能預(yù)測高級別T1分期膀胱癌的復(fù)發(fā)、進展和CSS。一項單中心前瞻性研究通過長期隨訪調(diào)查102例高級別T1分期膀胱癌患者外周血中CTC對CSS和OS的影響發(fā)現(xiàn)，即使是單個CTC存在也可以預(yù)測較低的CSS和OS，其中位隨訪時間為63個月[21]。該研究提示通過CTC檢測可識別超高風(fēng)險NMIBC患者，故可對其進行更密切的隨訪，早期進行根治性手術(shù)甚至全身治療，從而改善患者預(yù)后。

有研究顯示，外周血CTC陽性與膀胱癌患者較差的OS、無進展生存率/無病生存率相關(guān)，提示外周血中CTC的存在是膀胱癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)[5]。這證實了CTC用于監(jiān)測遠期轉(zhuǎn)移進展膀胱癌患者術(shù)后的價值。另外，Abrahamsson等[11]首次證明了CTC的存在與18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計算機斷層掃描放射性轉(zhuǎn)移性疾病的風(fēng)險增加有關(guān)，且與根治性膀胱切除術(shù)治療的晚期膀胱癌患者的早期進展相關(guān)。

因此，CTC與膀胱癌進展及復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為臨床上初步判斷膀胱癌患者的預(yù)后指標(biāo)。

3 小 結(jié)

CTC檢測因具有微創(chuàng)、快速、便捷、特異性高等優(yōu)點，在膀胱癌的診療中已逐步開展并發(fā)揮巨大潛力。然而目前各種檢測CTC的方法總體敏感性偏低[5]，不能用于膀胱癌的早期篩查，且各種CTC檢測方式的價格均較高，這限制了CTC在臨床的廣泛運用，故需進一步開發(fā)價格低廉、敏感性和特異性較高的技術(shù)。

研究發(fā)現(xiàn)，與其他癌癥循環(huán)生物標(biāo)志物相比，CTC作為游離DNA可以更好地預(yù)測總體生存率[36]，在幫助早期干預(yù)、治療決策和治療反應(yīng)評估方面具有巨大的應(yīng)用價值[37]。且據(jù)文獻報道，CTC和循環(huán)腫瘤DNA可能在預(yù)后和轉(zhuǎn)移評估中具有互補作用[36]。因此，兩者的共同檢測在未來膀胱癌的診療中或許能發(fā)揮更大的作用。雖然目前在膀胱癌的診療中尚缺乏運用CTC檢測的大規(guī)模臨床前瞻性研究，但相信隨著對CTC多種檢測方法統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)和嚴格的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制系統(tǒng)的建立，CTC檢測將在膀胱癌診療甚至臨床個體化醫(yī)療的推廣應(yīng)用中具有更大的發(fā)展前景。