何關(guān)金

(廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院〈廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院〉 廣東 佛山 528000)

0 引 言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)手段，用于特定核酸片段的相對(duì)定量和絕對(duì)定量，自20世紀(jì)70年代問(wèn)世以來(lái)，在生命科學(xué)、分子診斷、醫(yī)學(xué)研究以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，為人類的生命健康和自然的和諧發(fā)展發(fā)揮了巨大作用[1]。PCR技術(shù)分為 3個(gè)階段，即普通 PCR、實(shí)時(shí)定量 PCR(quantitative PCR，qPCR)和數(shù)字 PCR(digital PCR，dPCR)[2-4]。

數(shù)字PCR技術(shù)于20世紀(jì)末提出，其原理是將實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系通過(guò)一定的技術(shù)手段進(jìn)行有限元分區(qū)，形成數(shù)以萬(wàn)計(jì)的單一反應(yīng)體系，當(dāng)分區(qū)足夠多時(shí)，根據(jù)泊松分布原理，以沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的陰性分區(qū)比例可以計(jì)算出目標(biāo)分子的起始拷貝數(shù)，從而計(jì)算出濃度等。作為絕對(duì)定量技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度高，線性范圍廣。根據(jù)泊松分布原理，分區(qū)數(shù)量越多，所獲得的結(jié)果越精確[5]。

初期的數(shù)字PCR技術(shù)主要以多孔芯片中的微反應(yīng)室(多至 20000孔)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行分散，其固有的缺點(diǎn)是分散單元數(shù)量相對(duì)較少，且載樣過(guò)程復(fù)雜不易重復(fù)[4]。微滴式數(shù)字 PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技術(shù)作為一種更靈活的方法，被越來(lái)越多地研究和應(yīng)用[6-8]。針對(duì)微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的龐大應(yīng)用市場(chǎng)，配套的數(shù)字 PCR檢測(cè)設(shè)備越來(lái)越多地受到國(guó)內(nèi)外相關(guān)行業(yè)公司的關(guān)注[9]。

本文設(shè)計(jì)了一種基于微流控技術(shù)的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)儀，用于檢測(cè)微滴擴(kuò)增后產(chǎn)生的熒光信號(hào)，通過(guò)采集、分析熒光信號(hào)波形得到陰性微滴比例，根據(jù)泊松分布原理從而得到靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。本儀器設(shè)置 2個(gè)熒光檢測(cè)通道，具有檢測(cè)靈敏度高、線性范圍廣、結(jié)果分群明顯等優(yōu)勢(shì)，能快速準(zhǔn)確定量核算分子濃度，可應(yīng)用于腫瘤、感染性疾病、基因多態(tài)性、多基因遺傳病診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 儀器設(shè)計(jì)與制造

1.1 硬件設(shè)計(jì)方案

檢測(cè)儀系統(tǒng)框圖如圖1所示。通過(guò)進(jìn)樣針、切向閥、注射泵配合使用抽取微滴，并驅(qū)動(dòng)流過(guò)微滴檢測(cè)芯片，在十字口經(jīng)載體油推動(dòng)排列成單個(gè)微滴的序列進(jìn)入檢測(cè)位置，如圖2所示。LED激發(fā)光源激發(fā)微滴內(nèi)針對(duì)不同基因探針標(biāo)記的FAM或VIC熒光染料，2種熒光染料發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm(FAM熒光)和554nm(VIC熒光)。通過(guò)光學(xué)組件將 2種熒光分離，并通過(guò)2組PMT探測(cè)器采集熒光信號(hào)，將其轉(zhuǎn)換為模擬信號(hào)。2路模擬熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)二階有源濾波器濾除噪聲后送入 16位 ADC轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，通過(guò)FPGA對(duì) 2路信號(hào)進(jìn)行快速采集。ADC采樣芯片選擇 ADI公司的 AD1377，該芯片輸入電壓范圍廣，線性誤差小，采樣速度高。ADC采集到的熒光波形數(shù)據(jù)傳輸給主CPU(STM32F103)，并通過(guò)USB接口將數(shù)據(jù)傳送到PC端電腦分析軟件。

為了完成微滴在96孔板中不同孔位進(jìn)樣還需要控制三維運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)對(duì)孔位的定位。三維機(jī)構(gòu)運(yùn)動(dòng)采用3組帶編碼器的無(wú)刷電機(jī)閉環(huán)控制，實(shí)現(xiàn)位置精確定位及確保微滴抽取完全。通過(guò)控制注射泵的運(yùn)動(dòng)和切向閥的轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)微滴進(jìn)樣、抽樣、液路清洗等過(guò)程。儀器采用步進(jìn)電機(jī)控制進(jìn)樣門的開合，操作簡(jiǎn)單。本檢測(cè)儀還加入了廢液油過(guò)量檢測(cè)、檢測(cè)油空、96孔板未安裝等故障檢測(cè)功能，以確保實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行。

無(wú)刷直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)器采用 A4989三相集成驅(qū)動(dòng)芯片控制。A4931是Allegro MicroSystems公司推出的三相無(wú)刷直流電機(jī)電機(jī)的前置驅(qū)動(dòng)器，可驅(qū)動(dòng)多種N溝道的功率 MOSFET，支持的馬達(dá)供電電源高達(dá)30V，同時(shí)還具有堵轉(zhuǎn)保護(hù)、過(guò)熱停機(jī)、過(guò)壓監(jiān)視等功能。DIR端口控制電機(jī)的運(yùn)動(dòng)方向，PWM 端口控制電機(jī)的運(yùn)動(dòng)速度，Brake端口用于電機(jī)剎車，防止過(guò)沖。同時(shí)通過(guò)FG1和FG2可以準(zhǔn)確測(cè)量電機(jī)的旋轉(zhuǎn)速度。AM26LV31為單端轉(zhuǎn)差分信號(hào)的芯片，可以將外部輸入的Hall單端信號(hào)轉(zhuǎn)化為A4931需要的差分信號(hào)。同時(shí)，無(wú)刷直流電機(jī)配 10000線的 ABZ編碼器用作閉環(huán)位置反饋信號(hào)，為編碼器信號(hào)輸入口，濾波后與CPU相連。

圖1 檢測(cè)儀系統(tǒng)框圖Fig.1 Detector system block diagram

圖2 熒光檢測(cè)流道Fig.2 Fluorescence detection flow path

1.2 熒光信號(hào)處理系統(tǒng)

系統(tǒng)熒光信號(hào)處理過(guò)程如圖3所示。采集的熒光信號(hào)并不是平滑的，存在一些由于電源波動(dòng)、流體雜質(zhì)、信號(hào)干擾等造成的隨機(jī)噪聲，隨機(jī)噪聲將對(duì)后期峰值提取造成失效或不準(zhǔn)的影響。在峰值提取之前需要對(duì)信號(hào)進(jìn)行濾波處理。另外，在微滴熒光檢測(cè)過(guò)程中，熒光檢測(cè)點(diǎn)位于玻璃檢測(cè)芯片微流道的中間。由于檢測(cè)油的液體折射、散射和玻璃材質(zhì)芯片散射光的作用，整體的熒光數(shù)據(jù)會(huì)出現(xiàn)整體向上偏移。因此，峰值提取前進(jìn)行了基線調(diào)整。

圖3 熒光信號(hào)處理過(guò)程Fig.3 Fluorescence signal processing

波形識(shí)別情況更為復(fù)雜，當(dāng)微滴較好地均勻離散通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，微滴波形呈現(xiàn)高斯分布。但是，實(shí)際中微滴通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)時(shí)并不理想，會(huì)存在多個(gè)微滴同時(shí)通過(guò)、重疊通過(guò)的情況，同時(shí)還存在流體中雜質(zhì)發(fā)出非正常熒光信號(hào)干擾的情況，針對(duì)每種情況需要識(shí)別，然后保留或剔除。為了檢測(cè)突變基因變異程度，本微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)儀設(shè)計(jì)了FAM和VIC 2種熒光通道，但引入了通道間熒光值串?dāng)_的問(wèn)題，因此我們對(duì)每個(gè)通道熒光值進(jìn)行了補(bǔ)償。

1.3 熒光補(bǔ)償

“熒光補(bǔ)償”是指修正熒光光學(xué)信號(hào)在探測(cè)器相互滲透并被數(shù)字化檢測(cè)的過(guò)程。熒光補(bǔ)償不足會(huì)導(dǎo)致弱陽(yáng)性群體使假陽(yáng)性顆粒增多，過(guò)度補(bǔ)償則會(huì)丟失弱陽(yáng)性群體而導(dǎo)致假陰性。經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)不同濃度的單熒光探針雙通道的實(shí)驗(yàn)，確定了不同濃度熒光素鈉在同時(shí)通過(guò)2種通道時(shí)，2種通道采集的熒光數(shù)據(jù)呈線性分布。因此，可以采用線性的方式補(bǔ)償熒光。

x定義為在n探測(cè)器中檢測(cè)到的來(lái)自x熒光的信號(hào)。這樣fF1就是指FAM探測(cè)器中FAM探針熒光的信號(hào)；vF2是指VIC熒光探測(cè)器中VIC熒光的信號(hào)。Dn是指探測(cè)n所檢測(cè)到的熒光信號(hào)[10-11]。于是有：

x熒光在其他探測(cè)中的信號(hào)將與xFn計(jì)算例(n指代專門收集此熒光的探測(cè)器)；這樣，如要知道有多少真正的FAM或VIC信號(hào)，就需要計(jì)算fF1和vF2?，F(xiàn)已知的比值恒定。同理，比值恒定。比值定義如下：

同理，由單一VIC熒光補(bǔ)償質(zhì)控物實(shí)驗(yàn)可得：

由公式(1)(2)(7)(8)可得：

FAM探測(cè)器中真正FAM熒光值為：

VIC探測(cè)器中真正VIC熒光值為：

補(bǔ)償后的峰值為單色熒光產(chǎn)生的實(shí)際值，根據(jù)自動(dòng)閾值劃分算法確定陰陽(yáng)區(qū)分的閥值，熒光幅值大于等于閥值劃分為陽(yáng)性微滴，熒光幅值小于閥值劃分為陰性微滴。

1.4 樣本濃度及變異比率計(jì)算

數(shù)字PCR是利用直接計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量，在PCR擴(kuò)增后有熒光信號(hào)的微滴確定為陽(yáng)性微滴，無(wú)熒光信號(hào)的微滴記為陰性微滴。把樣本通過(guò)微滴生成方法均勻分割后，理論上每個(gè)有熒光信號(hào)的微滴代表一個(gè)DNA分子拷貝數(shù)。但是，在通常情況下，數(shù)字PCR反應(yīng)單元(單個(gè)微滴)中可能包含2個(gè)或2個(gè)以上的目標(biāo)分子，這時(shí)需要用泊松分布公司進(jìn)行計(jì)算[12]。

式中：λ為每個(gè)反應(yīng)單元(單個(gè)微滴)中包含目標(biāo)DNA分子的平均拷貝數(shù)(濃度)；P為在一定的λ條件下，總反應(yīng)體積中所包含k個(gè)拷貝目標(biāo)DNA分子的概率。

而λ由樣本的稀釋倍數(shù)m決定：

同時(shí)，k＝0時(shí)，P可以看作陰性微滴個(gè)數(shù)(無(wú)熒光信號(hào)反應(yīng)單元的個(gè)數(shù))與微滴總個(gè)數(shù)(總反應(yīng)單元個(gè)數(shù))的比值，即：

其中，n為微滴總數(shù)，f為陽(yáng)性微滴個(gè)數(shù)，對(duì)等式(12)兩邊取對(duì)數(shù)(ln)得

1μL體積下的拷貝數(shù)為：D=c/V(V為總反應(yīng)體積，單位為μL)

用FAM通道內(nèi)探針標(biāo)記突變型基因，得到突變基因的拷貝數(shù)d1；用VIC通道內(nèi)探針標(biāo)記野生型基因，得到野生型基因的拷貝數(shù)為d2。由公式(13)可確定基因突變率。

1.5 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

數(shù)據(jù)分析軟件作為檢測(cè)儀重要組成部分，完成對(duì)熒光檢測(cè)數(shù)據(jù)的分析，向用戶直觀展現(xiàn)陽(yáng)性微滴、陰性微滴、總微滴、微滴拷貝數(shù)、基因變異系數(shù)等數(shù)值信息，同時(shí)通過(guò)一維和二維圖形展現(xiàn)微滴分群情況。分析軟件系統(tǒng)框架如圖4所示，由實(shí)驗(yàn)設(shè)置、實(shí)驗(yàn)運(yùn)行、數(shù)據(jù)分析、系統(tǒng)設(shè)置以及幫助5個(gè)部分組成。

圖4 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)軟件架構(gòu)圖Fig.4 Software architecture diagram of data analysis system

實(shí)驗(yàn)設(shè)置(Mode)界面可以對(duì)需要運(yùn)行的孔位、樣本名稱、實(shí)驗(yàn)類型、檢測(cè)類型等進(jìn)行設(shè)置，同時(shí)可以加載之前保存的設(shè)置。

實(shí)驗(yàn)運(yùn)行(Run)界面直觀展現(xiàn)當(dāng)前檢測(cè)的孔位，執(zhí)行進(jìn)度以及上一個(gè)孔檢測(cè)結(jié)果的一維圖和二維圖，如圖5所示。

圖5 系統(tǒng)軟件運(yùn)行界面Fig.5 System software operation interface

圖6 系統(tǒng)軟件分析界面Fig.6 System software analysis interface

分析界面(Analyze)顯示通過(guò)Mode界面加載的孔的結(jié)果數(shù)據(jù)(圖6)。分析界面分為結(jié)果圖窗口、結(jié)果表窗口和孔選擇窗口。結(jié)果圖窗口以一維圖、二維圖的形式展示了微滴分布的結(jié)果；結(jié)果表窗口以表格方式展示了對(duì)應(yīng)孔位檢測(cè)的陽(yáng)性微滴數(shù)、陰性微滴數(shù)、總微滴數(shù)、總拷貝數(shù)等信息?？走x擇窗口為用戶自由選擇對(duì)比孔提供了便利，方便同類實(shí)驗(yàn)對(duì)比。

系統(tǒng)設(shè)置(System)界面可以設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)，如微滴直徑、樣本體積、數(shù)據(jù)保存路徑、數(shù)據(jù)保存類型等。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證本套數(shù)字PCR系統(tǒng)的準(zhǔn)確性與精度，本研究購(gòu)買了Horizon(#HD780)突變頻率為5%、1%、0.1%、0%標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣本2個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果顯示，同一次試驗(yàn)中2個(gè)結(jié)果較為相近，與標(biāo)準(zhǔn)品提供的拷貝數(shù)一致，同一樣本的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的CV≤5%，擴(kuò)增后陰陽(yáng)微滴區(qū)分明顯(圖7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本套數(shù)字PCR儀器準(zhǔn)確性好，精度也比較高。

圖7 Horizon檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Result of horizon detection

為驗(yàn)證儀器線性范圍和線性相關(guān)性，本研究采用自主構(gòu)建的 EGFR L858R突變型和野生型質(zhì)粒進(jìn)行了線性測(cè)試，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下所述。

①樣本制備：使用 Magen質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈|(zhì)粒，使用Qbit和Bio-rad Q200數(shù)字PCR體系配合對(duì)提取的質(zhì)粒定量，通過(guò)稀釋得到質(zhì)粒濃度梯度為10拷貝數(shù)至 1000000拷貝數(shù)(101～106)共 6個(gè)梯度。

②擴(kuò)增體系制備：通過(guò)移液槍依次加入自主研發(fā)的 2X Mix 10μL，EGFR L858R 上下引物各1800nmol野生型探針(VIC通道)和突變型探針(FAM通道)各500nmol梯度樣本各1μL試劑，最后使用ddH2O補(bǔ)足20μL，最終形成20μL體系的水相擴(kuò)增體系。

③微滴生成：將20μL的水相用移液槍轉(zhuǎn)移到配套微滴生成芯片的水相 Well中，將 30μL自主研發(fā)的微滴生成油(含高性能表面活性劑)轉(zhuǎn)移到微滴生成芯片的油相 Well中。將生成芯片置于配套開發(fā)的微滴生成儀中，一鍵運(yùn)行等待運(yùn)行完成。微滴生成完成后，在微滴生成芯片的出口 Well中的上層形成直徑約為70μm、數(shù)量約為10萬(wàn)個(gè)的乳白色微滴層。

④微滴轉(zhuǎn)移、封膜與擴(kuò)增：將電動(dòng)移液槍移液體積設(shè)置為 45μL，然后利用電動(dòng)移液槍將微滴生成芯片出口Well中的微滴轉(zhuǎn)移至艾本德的96孔PCR板中。利用自主研發(fā)的PCR板封膜儀將PCR板封上鋁膜后轉(zhuǎn)移到 ABI的熱循環(huán)擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序見表1。

表1 FAM和VIC通道101-106拷貝數(shù)梯度檢測(cè)結(jié)果Tab.1 FAM and VIC channel 101-106 copy number gradient test results

⑤微滴檢測(cè)：擴(kuò)增結(jié)束后，直接將 96孔板移至自主研發(fā)的數(shù)字 PCR檢測(cè)儀中檢測(cè)微滴陰陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果見表1。

⑥數(shù)據(jù)分析：將檢測(cè)軟件分析后獲得拷貝數(shù)取對(duì)數(shù)，使用 Excel中圖標(biāo)分析工具分析樣本濃度梯度的線性系數(shù)，分析數(shù)據(jù)結(jié)果顯示突變型和野生型拷貝數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于 0.99(圖8～9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本儀器線性范圍廣，穩(wěn)定性好。

圖8 單通道突變性拷貝數(shù)相關(guān)系數(shù)Fig.8 Single-channel mutant copy number correlation coefficient

圖9 單通道野生性拷貝數(shù)相關(guān)系數(shù)Fig.9 Single-channel wild copy number correlation coefficient

3 結(jié) 論

數(shù)字PCR屬于第三代PCR技術(shù)，相比于第二代熒光定量 PCR的相對(duì)定量和第一代 PCR定性具有絕對(duì)定量的能力，是 PCR技術(shù)發(fā)展的重要方向之一。本文從硬件設(shè)計(jì)、熒光檢測(cè)、軟件設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理等方面論證了數(shù)字 PCR儀器的原理，并依據(jù)理論設(shè)計(jì)研發(fā)了流式微滴數(shù)字 PCR檢測(cè)儀。本儀器能夠快速檢測(cè) 70μm 微滴的熒光信號(hào)，結(jié)合相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理算法能夠根據(jù)微滴熒光強(qiáng)度判定微滴的陰陽(yáng)性，結(jié)合泊松分布模型實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì) 定量。

通過(guò)對(duì)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品 Horizon的測(cè)試，確定本研究中的數(shù)字 PCR系統(tǒng)能夠區(qū)分微滴的熒光強(qiáng)度，且具有非常高的準(zhǔn)確性和精度，推廣測(cè)試實(shí)驗(yàn)室制備的質(zhì)粒樣本梯度標(biāo)準(zhǔn)品。兩通道拷貝數(shù)結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù) R2均大于 0.99，進(jìn)一步證明本研究中數(shù)字 PCR系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，具有應(yīng)用價(jià)值。另外，在本套數(shù)字 PCR系統(tǒng)上探索了多位點(diǎn)基因突變檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)多重測(cè)試，在每通道各 2個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)中，通過(guò)調(diào)整引物和探針量，二維結(jié)果圖中準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn) 16分群，有效提高了檢測(cè)效率，降低檢測(cè)成本，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。